引言：RAS 家族（KRAS、NRAS 和 HRAS）是癌症中最常发生突变的基因家族，一度被认为是不可成药靶点。然而，G12C 药物的上市为其带来了转机。
# 摘要
RAS 家族（KRAS、NRAS 和 HRAS）是癌症中最常发生突变的基因家族，因此，三十多年来，研究人员一直在寻找有效的 RAS 抑制剂。即使是在 10 年前，RAS 抑制剂的研发也是如此困难，以至于 RAS 被称为 "不可成药靶点"。现在，随着针对非小细胞肺癌中最频繁的 RAS 突变类型 KRASG12C 的等位基因特异性共价抑制剂的成功，让我们有机会评估治疗 RAS 驱动的癌症的最佳治疗策略。突变的生化特性以及原发组织可能会影响此类治疗的有效性。目前，通过等位基因特异性抑制剂为直接抑制突变的 RAS 提供了最佳的治疗方案。针对 RAS 激活途径或 RAS 效应途径的疗法可与这些直接的 RAS 抑制剂、免疫检查点抑制剂或 T 细胞靶向方法相结合，以治疗 RAS 突变的肿瘤。这里我们回顾了针对突变 RAS 蛋白的疗法的最新进展，并讨论了这些包括联合治疗的策略疗法的未来挑战。
# 简介
RAS（KRAS、NRAS 和 HRAS）是癌症中最常发生突变的基因家族。KRAS 的突变是三种最致命的癌症（肺癌、结直肠癌（CRC）和胰腺癌）的已知驱动因素。三十多年来，针对抑制 RAS 驱动的肿瘤发生的有效治疗方法的开发一直没有进展，因此 RAS 被认为是 "不可成药的"。然而，由于美国食品和药物管理局 (FDA) 已授予一种等位基因特异性共价抑制剂 AMG 510 快速通道认定，一种经临床批准的突变体选择性 KRAS 疗法已近在眼前。AMG 510 与 KRAS-G12C 结合，这是非小细胞肺癌中最常见的 RAS 突变体。对 KRAS-G12C 的成功抑制，为一系列突变 RAS 等位基因特异性靶向治疗带来了希望，并且在临床治疗上是操作的。
在正常细胞中，RAS 在生长因子受体下游的膜上被激活，包括表皮生长因子受体（EGFR）家族的成员（图 1）。这个家族包括 EGFR 本身以及相关的 ERBB 受体（在人类中被称为 HER）。RAS 是一个小开关信号 GTP 酶，在其 GTP 结合的活性状态和 GDP 结合的非活性状态之间进行切换。尽管 RAS 蛋白同时表现出内在的 GTP 水解和核苷酸交换，但其细胞信号状态是由催化 GTP 负载的鸟嘌呤交换因子（GEFs）激活和增加 GTP 水解的 GTP 酶激活蛋白（GAPs）失活而产生的。在其 GTP 结合状态下，RAS 直接与几个下游效应途径相互作用并激活，包括丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇 3 - 激酶（PI3K）途径。RAS 的突变破坏了鸟嘌呤交换周期，典型的方式是不依赖于 GAP 活性，并将 RAS "锁定" 在活跃的 GTP 结合状态，从而激活下游信号通路，导致肿瘤细胞生长。
在本综述中，我们描述了针对突变 RAS 蛋白的治疗方法的最新进展，并讨论了可能增加 RAS 抑制的临床效益的联合策略（图 1）。首先，我们讨论不同 RAS 异构体的普遍性及其生化特性的差异。然后，我们讨论最近直接或间接抑制 RAS 的策略，强调了针对 KRAS-G12C 的突破性疗法以及阻断 SOS1、SHP2（PTPN11）和 RAS 膜关联的抑制剂。其次，我们介绍了针对 RAS 本身以及 RAS 效应途径（即 MAPK 和 PI3K）的抑制剂的临床进展。最后，我们详细介绍了治疗 RAS 突变型肿瘤的新兴治疗策略。
图一
# RAS 突变和剪接变体
RAS 突变是许多癌症遗传驱动因素，包括 CRC、胰腺导管腺癌（PDAC）、肺腺癌（LUAD；非小细胞肺癌（NSCLC）的一个亚型）、黑色素瘤和某些血液学癌症。尽管这些肿瘤类型是由 RAS 突变驱动的，但 RAS 突变的同种异形体（KRAS、NRAS 或 HRAS）、密码子和频率因组织类型而异（图 2）。例如，很大比例的 LUAD（32%）、PDAC（86%）和 CRC（41%）（图 2a）是由 KRAS 突变驱动的，在这些肿瘤类型中突变主要发生在密码子处（图 2b）。相比之下，29% 的黑色素瘤由 NRAS 突变驱动，与 KRAS 不同，这些突变发生在 61 号密码子（图 2）。HRAS 突变发生的频率低于 KRAS 或 NRAS 的突变，但有一部分头颈部鳞状细胞癌（HNSCC；5%）和膀胱癌（6%）是由 HRAS 突变驱动的，这些突变发生在密码子 12 或 61（图 2a）。基因工程小鼠模型（GEMMs）再现了在患者肿瘤中观察到的同种异体和密码子突变的偏好。KrasG12D 在结肠上皮细胞中的表达导致增殖过度，但 NrasG12D 在这些细胞中的表达并没有改变细胞增殖特性。在黑色素细胞中表达 NrasQ61R，而不是 NrasG12D，会诱发黑色素瘤。因此，针对 RAS 驱动的癌症的方法必须考虑到特定的异构体和特定的密码子突变。
KRAS 基因编码两个剪接变体，通过使用不同的第 4 顺位外显子，产生了 KRAS4A 和 KRAS4B 两种亚型。KRAS4A 在 C 端含有额外的 22 或 23 个氨基酸，因此具有不同的翻译后修饰和膜定位功能。KRAS4B 长期以来被认为是主要的异构体，因为它在人类癌症中无处不在且高度表达。然而，在最近，KRAS4A 被证明在癌细胞系中广泛表达，并在结直肠肿瘤中与 KRAS4B 表达水平相当。KRAS4A 在 GEMMs 中被认为是可有可无的：外显子 4A 的基因缺失会导致胚胎成活，而 Kras 的缺失会导致胚胎死亡。最近，Kras4B 也被证明在小鼠中是可有可无的，表明这两种异构体在发育过程中是多余的。然而，Kras4A 或 Kras4B 的缺失能够抵抗肺部肿瘤形成，这表明肿瘤的发生需要两种异构体。这两种异构体在肿瘤微环境中也可能有特定的作用，KRAS4A 的表达增加了对压力的适应性，如缺氧，而 KRAS4B 则表达于干细胞和祖细胞。肿瘤可以通过剪接表达 KRAS4A17，来适应压力。这些近来的研究重新关注了 KRAS4A 在肿瘤发生中的作用，并改变了抑制 KRAS 治疗的观点，因为现在需要重新考虑 KRAS4A 的作用。
# 突变 RAS 的生化特征
小 GTP 酶，如 RAS，在 GDP 结合的非活性状态和 GTP 结合的活性状态之间循环（图 3）。GEFs，如 SOS 或 RAS 鸟嘌呤核苷酸释放蛋白（RasGRP），促进 GDP 与 GTP 的交换。为了刺激 GTP 水解，从而使 RAS 回到非活性 GDP 状态，RAS GAPs，如神经纤维素（NF1）或 p120GAP，介导 GTP 水解。RAS 的第 12、13 和 61 号密码子的突变破坏了 GAP 介导的 GTP 水解，使这些突变体在持续的 GTP 结合状态下积累（图 3a,b）。GTP 结合的 RAS 激活下游效应途径以促进细胞增殖，最明显的是 MAPK 和 PI3K 途径。
内在 GTP 酶和 GDP-GTP 交换率在不同的 RAS 突变体之间可能有所不同，这一观点可能为如何最好地针对每个突变体提供启示。例如，密码子 12、13 和 61 突变体一般都有内在 GTP 酶活性减弱，但 KRAS-G12C 除外，尽管其 p120 GAP 介导的水解率降低，但其表现出接近野生型内在 GTP 酶活性 （图 3c）。事实上，Shokat 等人利用 KRAS-G12C 的这一独特的生化特性，利用与 KRAS-G12C 的 GDP 结合状态结合的共价抑制剂来靶向 KRAS-G12C。相比之下，KRAS-G13D 相对于野生型 RAS 具有更高的内在交换活性，这表明 GDP 结合状态是短暂的 23。密码子 13 突变的 KRAS 对 NF1 GAP 介导的水解部分敏感，而密码子 12 或 61 突变的 KRAS 异构体对 NF1 不敏感。有趣的是，KRAS 密码子 13 的突变经常与 NF1 突变共同突变，进一步体现了肿瘤的进展压力，即摆脱 KRAS-G13 的 NF1 GAP 活性，从而增加生化活性。RAS 突变版本之间的生化性质差异将决定 RAS 的核苷酸结合状态，因此最适合用等位基因特异性抑制剂来靶向。低水平的 GTP 酶活性或高水平的鸟嘌呤交换可能对靶向 GDP 结合位点带来困难。
图二
# 直接靶向 RAS 的方法
直接抑制 RAS 是治疗 RAS 突变肿瘤的一个理想方法。在此，我们阐明了直接针对 RAS 的最新努力，包括开发开关 - II 突变体选择性共价抑制剂和泛 RAS 抑制剂。目前研究人员正在大力开发突变体特异性 RAS（KRAS-G12C）开关 - II 共价抑制剂，并且正在取得进展。
# 靶向 KRAS-G12C 的共价抑制剂
Kras 是小鼠发育所必需的，而 Nras 和 Hras 是可有可无的。如果人类在这方面是相似的，那么在靶向野生型 KRAS 蛋白时，对 KRAS 的这种要求会产生毒性问题。然而，当 Kras 被 Hras 取代时，小鼠是可以生存的，这就减少了对靶向 KRAS 毒性的担忧。同时，成年小鼠中 Kras 的条件性缺失将直接检验这些毒性相关问题，但这样的研究还没有发表。由 Shokat 等人开创的 RAS 抑制剂领域主要集中在对 KRAS-G12C 的共价抑制上，这将有望规避因抑制所有 RAS 异构体而产生的毒性。
半胱氨酸位于 KRAS-G12C 的第 12 个密码子上，其固有的化学反应性可被利用来创造共价小分子抑制剂。共价靶向活性部位的半胱氨酸是药物发现中广泛使用的一种策略。重要的是，野生型 KRAS 的活性部位缺乏半胱氨酸，因此 KRAS-G12C 可以用这种共价方法进行特异性抑制。如上所述，G12 密码子是 KRAS 的一个突变热点，G12C 是这个位置的第三大常见突变。G12C 突变主要发生在 LUAD 中，是与吸烟有关的转位突变（G>T 和 G>C）（图 2b）。
Shokat 等人首先在突变的 KRAS-G12C 蛋白 24 中发现了开关 - II 后面的一个新的异生结合口袋，称为开关 - II 口袋（图 4,5a,b）。他们开发了第一个系列的化合物来不可逆地靶向 KRAS-G12C。这些化合物在 GDP 结合状态下与 KRAS-G12C 结合，阻断了 SOS 催化的核苷酸交换，并阻断了 KRAS-G12C 与 RAF 的联系。值得注意的是，这些化合物只与处于 GDP 结合状态的 KRAS-G12C 结合，因此需要 KRAS-G12C 首先进行 GTP 水解。大约 75% 的 KRAS-G12C 在稳定状态下是 GTP 结合的，但 KRAS-G12C 在常见的致癌突变中具有最高水平的内在 GTP 酶活性，因此容易受到共价攻击 30（图 3c）。由于 KRAS 中除 KRASG12C 外的其他突变体的内在 GTP 水解率较低，目前还不清楚在这些其他突变体中通过类似的方法针对开关 - II 口袋是否会成功。
众多公司正在开发针对 KRAS-G12C 的更有效的抑制剂，其中一些分子已进入临床试验，但很少有细节被公布。AMG 510（图 4）是第一个进入临床试验的分子，I 期试验的初步结果很有希望，特别是在 NSCLC 中：在接受 960 毫克目标剂量的 13 名患者中，7 名患者有部分反应（PR），6 名患者病情稳定（SD）1（NCT03600883；表 1）。CRC 患者的反应就更不明显了：12 名患者中只有 1 名有 PR，10 名患者有 SD。值得注意的是，在该研究的总共 34 名患者中，没有人出现剂量限制性毒性或导致停药的不良事件。在临床前模型中，AMG 510 只对 KRAS- G12C 细胞系的细胞活力有有效的抑制（在 MiaPaCa-2 和 NCI-H358 细胞系中，半数最大抑制浓度（IC50）≈9 nM，IC50≈6 nM），并在异种移植模型中导致肿瘤的消退。当 AMG 510 与具有活性的或被 RAS 激活的蛋白抑制剂（如 MEK、AKT、PI3K、SHP2 和 EGFR 家族成员）或免疫疗法结合使用时，具有协同的肿瘤生长抑制作用。
MRTX849（图 4）也正在进行 I/II 期临床试验（NCT03785249；表 1）。在早期的临床研究中（七名患者，每天两次，每次 600 毫克），五名 NSCLC 患者中有三名获得了 PR，两名 CRC 患者中有一名获得了 PR。在临床前模型中，MRTX849 只在 KRAS-G12C 细胞系中有效地降低了细胞活力（在 MiaPaCa-2 和 NCI-H358 细胞中的 IC50≈94 nM 和 IC50≈107 nM），并在异种移植模型中引起肿瘤的消退。MRTX849 表现出协同效应，当与 EGFR 家族、SHP2、mTOR 或细胞周期蛋白依赖性激酶 4（CDK4）和 CDK6 的抑制剂联合使用时，甚至在 MRTX849 单药物难以治愈肿瘤中也能导致肿瘤消退 。在 CRISPR 筛选中，NRAS 或 KEAP1 的缺失导致对 MRTX849 的抵抗，而 SHP2、MYC 或 mTOR 通路基因的缺失则使肿瘤对 MRTX849 进一步敏感。
第三种 KRAS-G12C 共价抑制剂，JNJ-74699157（ARS-3248），目前正在进行 I 期临床试验（NCT04006301；表 1），结果尚未公布。两种以前的化合物（ARS-853 和 ARS1620；图 4）减少了细胞的生长，并抑制了下游的 MAPK 信号，这种抑制现象只在具有 KRASG12C 突变的肿瘤细胞系中出现。第四种 KRASG12C 共价抑制剂 LY3499446 目前正在进行 I/II 期临床试验（NCT04165031；Tables 1,2），作为单药治疗和与 CDK4/CDK6 或 EGFR 的抑制剂联合使用或与化疗（多西紫杉醇）联合使用。结果尚未公布。
由于所讨论的共价抑制剂需要 KRASG12C 处于 GDP 结合状态，KRASG12C 中可能出现抗性突变，使 GTP 酶活性失效或促进 GDP 与 GTP 的鸟苷交换。对共价 KRAS-G12C 抑制剂的耐药机制已通过 CRISPR 筛选确定，其中包括包括 NF1 或其他 RAS 异构体（NRAS 和 HRAS）之一的损失。
最近，人们发现了能同时结合 KRAS 的 GDP 结合和 GTP 结合状态的分子。这些分子结合了一个新的槽（开关 - II 槽），它与 switch-II 口袋相邻，但远离核苷酸结合部位（图 5c）。这一发现突出了开关 - II 口袋的动态性质，重要的是，它提供了重要概念：RAS 的两种核苷酸结合状态都可以成为抑制剂的目标。
图三
# 其他特定突变的方法
如上所述，KRASG12C 突变只占 KRAS 突变的一部分，主要存在于 LUAD 中（图 2b）。为了有效地抑制其他常见的 KRAS 突变，KRASG12D 和 KRASG12V，需要采取不同的方法，因为这些突变体在活性部位缺乏反应性半胱氨酸。针对这些特定突变的抑制剂的开发将需要考虑生化差异，并评估以哪种状态（与 GDP 或 GTP 结合）为目标，因为每个突变在这些状态的普遍性方面都相对的有所不同。
Revolution Medicines 正在开发一种三复合物平台 RAS (ON)，其中一种化合物介导不同的突变 KRAS 蛋白（包括 KRAS-G12C）和一种伴侣蛋白（如环孢素 A39）之间的非天然的蛋白 - 蛋白相互作用。这种复合物的形成可防止突变体 KRAS 与 SOS 和含 RAS 结合域（RBD）的效应蛋白结合。有趣的是，这些分子（RM-007 和 RM-008）在 GTP 结合状态下分别与 KRAS-G12C 和 KRAS-G13C 共价结合，并在细胞中具有抗增殖活性。由于这种针对活性 GTP 结合状态的分子打破了典型的 GTP 构象或阻断了效应物的相互作用，像这样针对 GTP 结合状态的方法将克服对 GDP 结合的 KRAS-G12C 共价抑制剂的假定的抗性机制。
# RAS - 效应分子相互作用抑制剂
尽管针对特异突变的 KRAS-G12C 共价抑制剂是有效的，但要为每种突变的 RAS 蛋白确定有效的治疗方法将是很麻烦的。直接针对所有 RAS 蛋白（KRAS4A、KRAS4B、NRAS 和 HRAS）上的保守配体结合位点，可以提供一种单一的治疗方法来抑制各种突变和肿瘤类型的 RAS。其中一种化合物，即化合物 3144，与开关 - I 中的保守残基 Asp38 结合，阻止 RAS 与效应物的结合。化合物 3144 在体外与野生型 KRAS、NRAS 和 HRAS 结合，并在体内抑制了 KRAS-G13D 肿瘤的生长；然而，这种化合物据报道有毒性和脱靶效应。事实上，泛 RAS 抑制剂不太可能被临床接受，因为 RAS 在正常细胞信号中是必不可少的。所有三种 RAS 异构体的缺失会导致小鼠模型的胚胎死亡，并且在体外水平的实验中阻断细胞增殖。
一种早期的 RAS 结合的小分子，DCAI，对 RAS 上 SOS1 介导的核苷酸交换有弱抑制作用（图 5d）。与 KRAS 的结晶共沉淀显示，DCAI 结合了 α2 螺旋和核心 β 片之间的口袋，β1-β3，这里被称为 DCAI 口袋，它阻止了 RAS 和 SOS1 之间的相互作用。在 DCAI 口袋中结合的小分子阻止了 SOS1 介导的鸟嘌呤交换，因此 RAS 蛋白不能转化成 GTP 结合的活性状态，使这个口袋成为理想的药物目标。
两个独立的蛋白 - 蛋白相互作用化合物系列，Abd - 和 Ch-，在 DCAI 口袋中可逆地结合 RAS，并抑制 CRAF、RalGDS 和 PI3K 的催化 p110α 或 p110γ 亚基与突变的 KRAS、NRAS 或 HRAS 的相互作用 。第三种化合物 BI-2852 也与 DCAI 口袋结合，减少 SOS1 介导的交换，从而减少下游激酶 ERK 和 AKT 的磷酸化。
这些系列分子作为泛 RAS 抑制剂发挥作用；DCAI 口袋存在于野生型 RAS 蛋白中，因此这些化合物不是突变体选择性的抑制剂。然而需要进一步研究以优化突变体选择性的参数，因为泛 RAS 抑制可能会带来毒性问题。
图四
# 间接靶向 RAS 的方法
正常的 RAS 激活需要核苷酸交换、加工、膜定位和与效应物的结合。改变这些基本步骤之一可以用来间接抑制 RAS 的活性。
核苷酸交换周期 SOS 的抑制剂。最初阻断 GEF 对 RAS 的活性的工作确定了一种小分子，在开关 - I 和开关 - II 之间结合 KRAS（Kd=190μM），从而抑制 SOS 结合和 SOS 介导的核苷酸交换（图 5e）。接下来尝试抑制 SOS1-RAS 的相互作用，使用了一种被设计用以模拟 SOS 正交螺旋的分子。尽管该化合物以纳摩尔的亲和力与 SOS1 结合，但它的生物活性很低。然后，该领域转移了关注点，试图找到 SOS1 的小分子抑制剂。三个小组确定了与 SOS1 的 CDC25 结构域和 RAS-SOS1-RAS 三元复合物中与 RAS 的开关 - II 相邻的区域的小分子。有趣的是，小分子与该部位的结合能够激活或抑制 SOS1-RAS 的相互作用。一个小组发现了一种小分子抑制剂（BAY-293；图 1），它能在纳摩尔水平上抑制 SOS1-KRAS 的相互作用。然而，BAY-293 对 KRAS 突变体细胞增殖的抑制作用很弱（IC50 = 3 μM），但对野生型 KRAS 细胞的增殖抑制作用更强（IC50 = 1 μM）。值得注意的是，BAY-293 和 KRAS-G12C 共价抑制剂 ARS-853 在 KRAS-G12C 细胞模型中显示出协同的生长抑制作用。这一观察表明，SOS1 抑制剂可与结合到 GDP 状态的 KRAS-G12C 抑制剂联合使用，因为 SOS1 抑制剂将增加与 GDP 结合的 KRAS-G12C 的丰度。目前，一种 SOS1 抑制剂 BI-1701963 作为单药和与 MEK 抑制剂 trametinib 的联合治疗正在进行 I 期临床试验（NCT04111458；图 1；Tables 1,2）。
SHP2 抑制剂。SHP2 是一种非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，是 MAPK 途径全面激活的必要条件。编码 SHP2 的 PTPN11 的突变会导致 RAS 综合征，并且在大约 50% 的 Noonan 综合征患者中发现这种突变。尽管 SHP2 的生物学功能仍不清楚，但在目前的模型中，SHP2 作为一个支架蛋白，与 GRB2 和 SOS1 结合，从而增加 RAS 的核苷酸交换。抑制 SHP2 的功能类似于 SOS1 抑制剂，会阻止野生型 RAS 与 GTP 的负载。KRAS 突变体肿瘤依赖于 SHP2，因为在已形成的肿瘤中删除 PTPN11 会延迟肿瘤的进展，但不会诱发肿瘤的消退。
SHP-099（图 1）是通过化合物库的分子筛选确定的，它将 SHP2 锁定在自体抑制构象中，对 SHP2 具有强效和异源抑制作用（IC50=0.071μM）。在 KRAS- G12D 患者衍生器官和 PDAC 和 NSCLC 的异种移植模型中，SHP-099 与曲美替尼联合使用时能协同降低细胞增殖。然而，在 KRAS-G13D 突变的细胞系 MDA-MB-213 中没有观察到对 SHP-099 的敏感性。
一种强效和选择性的 SHP2 异生抑制剂 RMC-4550（图 1）能够与 SHP-099 相同的部位结合，稳定 SHP2 的自体抑制构象。在临床前模型中，用 RMC-4550 治疗可减少细胞增殖，但这种效果只在携带 KRAS 第 12 密码子突变的细胞中明显，而不是第 13 或 61 密码子突变的细胞。此外，在 KRASG12C 突变的细胞中观察到最大的敏感性；KRASG12D 或 KRASG12V 突变的细胞对该化合物有一定的敏感性。这一观察结果突出表明，每个突变的生化特性决定了 RAS 活性对鸟嘌呤交换的依赖程度，而固有的或 GAP 介导的水解升高的突变对 SHP2 抑制特别敏感。
源自 RMC-4550 的临床候选药物 RMC-4630（图 1）目前正在进行 I 期单药临床试验（NCT03634982；表 1）和 Ib/II 期临床试验，同时在另一项临床试验中与另一种 MEK 抑制剂 cobimetinib 联合使用（NCT03989115；表 2）。第二个 SHP2 别构抑制剂 JAB-3068（图 1），目前正处于 I/II 期临床试验中，结果尚未公布（NCT03518554，NCT03565003；表 1）。第三种 SHP2 抑制剂 TNO155（图 1）正在进行 I 期单药临床试验（NCT03114319；表 1）和与 MRTX849 联合进行的 I/II 期临床试验（NCT04330664；表 2）。这些研究的结果都还没有公布。
图五
# 抑制 RAS 翻译后加工的抑制剂
RAS 只有在定位到细胞膜上时才有活性。为了与膜结合，RAS 需要三个酶的翻译后处理步骤：法尼基转移酶（FT 酶）或香叶烯基转移酶（GGT 酶）对 CAAX 盒的预炔化；RAS 转化酶（RCE1）对末端 AAX 残基的裂解；以及异戊基半胱氨酸羧基甲基转移酶（ICMT）对 CAAX 盒的半胱氨酸残基的甲基化。抑制 RAS 加工应能阻止膜结合和下游的 RAS 信号传导。
尽管 FT 酶抑制剂（FTIs）在 KRAS 突变的癌症中的临床表现令人失望，可能是因为 FT 酶和 GGT 酶之间的功能重叠，但人们重新关注 FTIs 在 HRAS 突变的癌症中的应用。与 KRAS 和 NRAS 不同，HRAS 完全由 FT 酶预酰化，因此 FTIs 可用于治疗 HRAS 突变的癌症。事实上，在 HRAS 突变的 HNSCC 和 NSCLC 的病人模型中观察到了对 FTI tipifarnib 的反应。Tipifarnib 目前正处于治疗 HRAS 突变的 HNSCC 和甲状腺癌的 II 期临床试验中（NCT02383927；表 1）。在报告的结果中，有六名患者接受了 tipifarnib 治疗，其中四人获得了 PR，两人获得了 SD。
ICMT 的一个小分子抑制剂 cysmethynil（IC50=2.4μM），在体外（半最大有效浓度（EC50）≈20μM）和体内减少了 RAS 突变体细胞系的细胞生长。Cysmethynil 的结构修饰提高了 ICMT 的抑制效力，但这种化合物并不能抑制细胞生长。迄今为止最有效的 ICMT 抑制剂（IC50 = 1.3 nM）仅能温和地减少增殖（EC50 = 0.3 至 > 10 μM）。最近，另一种 ICMT 抑制剂 UCM-1336（IC50 = 2 μM）被发现能够损害所有四种 RAS 异构体的膜结合，而不考虑突变状态，并在体外（EC50 = 2-12 μM）和体内减少 RAS 突变体细胞系的细胞生长。UCM-1336 在结构上有别于 cymethynil 衍生的化合物，但仍需进一步改进，以便有效地进行治疗。目前还没有发现针对 RCE1 的强效和选择性的抑制剂。
在翻译后修饰后，RAS 的定位和转运受到异戊烯基结合蛋白磷酸二酯酶 -δ（PDEδ）的调节，它与法尼基化的 RAS 结合。Deltarasin 是一种与 PDEδ 的法尼基结合口袋结合的小分子，它能阻止 KRAS 的结合（Kd = 7.6nM），导致 KRAS 的错位并减少细胞的增殖。通过计算机分子对接确定了另一种化合物，NHTD，它破坏了 KRAS 与 PDEδ 的结合。NHTD 能够同时在体外和体内抑制突变的 KRAS 肿瘤细胞的生长（EC50 = 2-7μM），但没有与 deltarasin 相关的细胞毒性作用。
值得注意的是，上面讨论的酶也处理其他膜相关蛋白，这可能导致脱靶效应。因此，直接抑制 RAS 任然是最有潜力的主要治疗方案。
# RAS 的寡聚和效应子的结合
一旦 RAS 被有效地加工，RAS 蛋白就会在膜上定位，在那里它们进行寡聚或二聚，并是有效的 RAS 驱动的信号所需要的。研究观察到 RAS 蛋白组织成 5 到 9 个蛋白的同种异体的集合体，称为 "纳米团"，这种结构对激活下游途径很重要。最近，RAS 二聚体的发现是另一种可能的机制，通过这种机制，RAS 可以自我联合以稳定支架结构和信号活动。
RAS 二聚体和寡聚体很难在体外重组，通常必须在重组的脂质膜或纳米盘内对翻译后修饰的 RAS 进行研究。由于缺乏明确的结构和生化数据，定义 RAS-RAS 相互作用表面的分子细节的大多数努力仅限于计算模型与实验验证相结合，以及利用从储存在蛋白质数据库（PDB）的数百个 RAS 结构中的晶体包装相互作用的信息。尽管许多相互作用已经被识别和验证，但许多计算和实验研究都集中在一个单一的 RAS 二聚体相互作用上，即 α4-α5 地互作，这也是许多 HRAS、KRAS 和 NRAS 结构中普遍存在的一种晶体包装地相互作用。
α4-α5 相互作用被建议可以作为纳米制剂 NS1 的靶点。NS1 通过直接结合 α4-α5 互作位点（HRAS 的 Kd=13 nM，KRAS 的 Kd=65 nM）破坏 HRAS 和 KRAS 的自结合，减少下游途径的激活并抑制细胞增殖，同时使 RAS 的定位和 GTP 酶活性不受干扰。而进一步的工作应该定义和验证这些 RAS-RAS 相互作用的条件：最近的一项研究表明，完全处理的 KRAS 在广泛的浓度范围内，在脂质膜中保持单体。
一个新发现的 RAS 自我抑制机制，即膜闭塞，为靶向 RAS 蛋白 - 蛋白相互作用提供了另一个潜在途径。在膜闭塞中，RAS 和脂质膜之间的直接相互作用将 RAS 的效应子结合位点从细胞膜上封住。一种小分子，Cmpd2，可以与 RAS 和脂质膜之间的位点结合（Kd = 1 μM），促进膜闭塞并减少与 RAF 的 RBD 结构域结合。由于 RAS - 效应子位点的高度保守性（图 5g），这种类型的策略提供了一个有效抑制 RAS 驱动的所有下游信号通路的机会。
表一
表二
# 靶向 RAS 下游通路
目前有两种不同的方法来针对 RAS 途径：确定 RAS 突变后的合成致死基因，或针对上游的酪氨酸激酶受体（EGFR 家族）或是 RAS 下游的效应途径，即 MAPK 和 PI3K。
合成致死筛选。布罗德研究所的依赖性地图（DepMap）门户网站汇编了来自数百个癌症细胞系的 CRISPR 筛选的基因关键性分数。在 KRAS 突变体和 NRAS 突变体细胞系中，除了 RAS 本身，最重要的基因是 RAF1（编码 CRAF）和 SHOC2。一项独立的研究表明，RAF1 和 SHOC2 在 RAS 突变的人类急性骨髓性白血病细胞系中是必需的。
在 KrasG12V; Trp53-/-LUAD 小鼠模型中敲除 CRAF 可显著减少肿瘤大小。作者没有观察到 CRAF 消融的不良系统性效应，并且 CRAF 的缺失并没有改变 MAPK 信号，这表明 CRAF 在这种情况下可能不依赖于激酶活性。此外，在 KrasG12V; Trp53-/-PDAC 小鼠模型中，Egfr 和 Craf 的联合敲除引发了 PDAC 肿瘤的完全消退。同样，Craf 和 Egfr 的双重敲除在 GEMMs 中的耐受性良好。在第二种方法中，使用 PDAC 患者源性异种移植（PDXs），EGFR 和 CRAF 表达的双重敲除也减少了肿瘤的生长。这些发现突出了抑制 CRAF 的治疗优越性，并表明需要开发针对 CRAF 的选择性抑制剂。然而，由于 RAF 家族激酶结构之间的高度同源性，以及 CRAF 在这种情况下可能具有不依赖激酶活性的功能，因此可能需要新的方法来选择性地抑制 CRAF。
一个包含 SHOC2、MRAS 和蛋白磷酸酶 1（PP1）的磷酸酶复合物使 RAF Ser259 位点去磷酸化。这种去磷酸化减轻了 14-3-3 对 RAF 的负向调节，使 RAF 二聚化。因此，SHOC2 促进 RAF 二聚化，重要的是，SHOC2 是使 ERK 活性最大化的必要条件。在 KrasG12D; Trp53R172H 的 LUAD 小鼠模型中敲除 Shoc2，可减少肿瘤负担，延长生存期而无毒性。在第二种模型中，KRAS 突变和 EGFR 突变的 NSCLC 细胞系中 SHOC2 的基因缺失减少了异种移植模型的生长，并使细胞对 MEK 的抑制敏感（使用 selumetinib、trametinib、PD0325901 或 pimasertib）。一项 CRISPR-Cas9 筛选发现，SHOC2 的缺失能够与曲美替尼治疗合成致死。这些发现表明，SHOC2 抑制剂不仅可以作为单一药物提供治疗效果，而且还可能与 MEK 抑制剂联合使用。
靶向 EGFR 家族的疗法。也有证据表明 RAS 和 EGFR 家族的受体酪氨酸激酶之间存在相互作用。由于 EGFR 家族是 RAS 的上游，这些受体酪氨酸激酶的失活可以减少 RAS 的激活。如今研究的重点是抑制 EGFR，特别是用于治疗 RAS 突变的肿瘤。
使用西妥昔单抗或帕尼单抗（针对 EGFR 的单克隆抗体）改善了转移性 CRC 和野生型 KRAS 等位基因（也没有 NRAS、BRAF 或 PI3KCA（编码 PI3Kα 的催化亚单位）的突变）患者的总生存率和无进展生存率，但这些抗体对 KRAS 突变的肿瘤，特别是那些在密码子 12 或 13 的突变的肿瘤没有作用。这些临床试验的结果导致西妥昔单抗和帕尼单抗仅被批准用于治疗缺乏 KRAS 突变的转移性 CRCs。此外，EGFR 酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如厄洛替尼和吉非替尼，被批准用于治疗 EGFR 突变的 NSCLC，但作为单一疗法对 KRAS 突变的 NSCLC 无效。厄洛替尼被批准与吉西他滨联合治疗 PDAC，尽管获益有限：超过 90% 的 PDAC 患者有 KRAS 突变。
一项对西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性 CRC 的临床试验的回顾性研究分析了它们的临床效益与特定密码子突变的关系。KRAS-G13D 突变的肿瘤患者（n = 32）在接受西妥昔单抗治疗时，与其他 KRAS 突变的患者相比，总生存期和无进展生存期都有所提高。然而，在对帕尼单抗的第二次回顾性分析中，KRAS-G13D 突变的肿瘤患者被认为不太可能从这种治疗中获益。一项 II 期被称为 ICECREAM 临床试验正在进行中，以评估西妥昔单抗治疗具有 KRASG13D 突变的转移性 CRC 患者的疗效（ACTRN12612000901808；表 2）。
尽管野生型 KRAS CRCs 对西妥昔单抗治疗有反应，但最终转移性 CRCs 仍然能抵抗 EGFR 治疗，通过获得 KRAS 突变并将其作为一种耐药机制。在一项研究中，这些突变包括 KRAS 扩增（11 例中的 1 例）或 KRAS 体细胞突变，最常见的是 G13D（11 例中的 5 例）。然而，目前还不清楚这些突变是在西妥昔单抗治疗之前就存在于 KRAS 突变的克隆中，还是由于治疗而产生的。
在 GEMMs 中，Egfr 的遗传耗竭抑制了 KrasG12D 驱动的 PDAC 和 NSCLC 的发展。在具有 KRAS-G12D 或厄洛替尼耐药性的肿瘤中，发现除 EGFR 本身外的 EGFR 家族成员，如 ERBB2、ERBB3 和 ERBB4 的上调是一个耐药的早期事件。有趣的是，NSCLC 患者，包括那些有 EGFR 突变或 EGFR、HER2、HER3 或 HER4 扩增的患者，其生存率很低。用 FDA 批准的泛 ERBB 抑制剂阿法替尼或奈拉替尼治疗自身 KRAS-G12D 肿瘤，与厄洛替尼或吉非替尼治疗相比，肿瘤的大小和发病率都有所下降。目前，一项 I/II 期临床试验正在评估来那替尼与组蛋白去乙酰化酶抑制剂 divalproex sodium 联合治疗 RAS 突变实体瘤的疗效（NCT03919292；表 2）。
泛 ERBB 和 EGFR 抑制剂有希望与 MEK 或 KRAS-G12C 共价抑制剂联合使用。阿法替尼对 ERBB3 的抑制使 KRAS 突变的 CRC 和 NSCLC 细胞系对 MEK 的抑制敏感（通过司美替尼）。阿法替尼或奈拉替尼治疗，结合 MEK 抑制（通过曲美替尼），增加了 KRAS-G12D NSCLC 小鼠模型的生存率。每天对动物进行一周的治疗，并监测其存活率，结果表明这种组合方法能诱导出持久的效应。用 ARS-853 和厄洛替尼或吉非替尼治疗对 KRAS-G12C 细胞有协同作用，厄洛替尼减少了 KRAS- G12C 与 GTP 的结合。由于 ARS-853 和其他 KRAS-G12C 共价抑制剂在 GDP 结合状态下与 KRAS-G12C 结合，EGFR TKIs 的疗效表明，EGFR 能够激活突变的 RAS，而对 EGFR 的抑制减少了 GTP 结合的 KRAS-G12C 的数量，并体现了更好的疗效。
MAPK 通路：RAF 抑制剂。活跃的 GTP 结合的 RAS 促进 RAF 二聚体化和磷酸化，从而诱导 RAF 激酶活性，导致 RAF 底物 MEK1 和 MEK2 的磷酸化。磷酸化级联继续，最终使 MEK 磷酸化末端激酶 ERK1 和 ERK2。ERK 激酶活性既激活促进生长的转录因子，包括 ETS 家族的成员，同时也参与负反馈环路。这一动态过程控制着 MAPK 信号级联的持续时间和幅度。ERK 可以通过磷酸化上游成分 SOS 或 CRAF，或通过改变双特异性磷酸酶（DUSP）家族和 Sprouty（SPRY）家族的转录来负向抑制 MAPK 信号。DUSPs 使 ERK 去磷酸化，而 SPRYs 拮抗 SOS-GRB2 抑制受体酪氨酸激酶信号。为了有效治疗 RAS 突变的肿瘤，MAPK 途径必须几乎被完全抑制。实现这一目标的一个策略是使用针对 MAPK 途径的激酶抑制剂，并与本综述中讨论的针对其他机制的疗法相结合。
目前，针对 BRAF-V600 和 MEK 的激酶抑制剂被批准用于 BRAFV600 突变的转移性黑色素瘤，但不用于 RAS 突变的肿瘤。临床批准的 BRAF-V600 抑制剂，如威罗非尼和达拉菲尼，会诱导 RAF 激酶结构域中的 αC 螺旋向外移动。这些抑制剂能有效地抑制 RAF 单体（BRAF-V600 作为单体信号），但不能用于 RAS 突变的肿瘤，因为 RAS 突变的肿瘤通过 BRAF 和 CRAF 二聚体发出信号。此外，在 RAS 突变型肿瘤中，这些抑制剂已被证明可通过与野生型 RAF 结合，诱导 RAF 二聚体化和下游 MEK 和 ERK 的磷酸化，反而激活 MAPK 途径。这种激活取决于抑制剂的结合方式。在 RAS 突变的肿瘤中，RAF 二聚体抑制剂表现出的矛盾激活活性远低于已批准的 BRAF-V600 抑制剂。
RAF 二聚体抑制剂，如 AZ-628、belvarafenib、LY3009120 和 LXH-254，在 DFG - 外移、αC 内聚的活性部位结合 RAF（图 1）。这些抑制剂对 RAF 单体和二聚体都有效，尽管它们也能促进二聚体化，但它们的矛盾激活作用最小，因为它们能同时结合二聚体成分。其中许多抑制剂作为泛 RAF 抑制剂，并被报道对 RAS 突变和 BRAF 突变的肿瘤有疗效。一项评估 LY3009120 的 I 期临床试验由于缺乏临床疗效而终止，因为最佳的总体结果是 SD（在 8 名患者（15%）中观察到）。
目前，两个泛 RAF 抑制剂正处于治疗 RAS 突变肿瘤的 I 期临床评估中：belvarafenib（NCT02405065，NCT03118817；表 1）和 LXH-254（NCT02607813；表 1）。Belvarafenib 在 BRAF 突变型和 NRAS 突变型肿瘤患者亚群中作为单药治疗具有临床活性，在 6 名 BRAF 突变型黑色素瘤患者中的 2 名、7 名 BRAF 突变型 CRC 患者中的 2 名和 9 名 NRAS 突变型黑色素瘤患者中的 2 名观察到 PR。与 BRAF-V600 抑制剂不同，使用 belvarafenib 治疗不会诱发鳞状细胞癌，一种已知的矛盾激活结果。
MAPK 通路：MEK 抑制剂。目前，有三种针对 MEK 的异生激酶抑制剂考比替尼、曲美替尼和比美替尼被批准用于治疗 BRAFV600 突变的黑色素瘤。评估 MEK 抑制剂作为 RAS 突变型肿瘤的单一疗法的临床试验并没有发现任何改善，没有任何一种 MEK 抑制剂被临床批准用于治疗 RAS 突变型肿瘤。MEK 抑制剂和 RAF 抑制剂一样，在 RAS 突变的肿瘤中会诱发通路反馈循环，导致对这些肿瘤的疗效相对不大。
虽然单药 MEK 抑制剂在临床上对 RAS 突变的肿瘤基本无效，但 NRAS 突变的黑色素瘤有一定的敏感性（图 1）。例如，在宾米替尼的 II 期试验中，20% 的 NRAS 突变黑色素瘤患者有 PR。基于这些数据，一项比尼米替尼与达卡巴嗪相比的 III 期试验正在进行，以评估治疗 NRASQ61 突变患者的疗效（NCT01763164；表一）。此外，在一项二期试验中，与达卡巴嗪相比，皮马西尼改善了 NRAS 突变黑色素瘤患者的无进展生存期（NCT01693068）。在整个患者群体中，与达卡巴嗪相比，皮马西尼未能改善总生存期，因此没有获得 FDA 批准。值得注意的是，类似的 MEK 抑制剂治疗 KRAS 突变的 PDAC、CRC 和 NSCLC 的临床试验显示，这种治疗与标准治疗方法相比，没有任何益处。在细胞培养中，NRAS 突变的黑色素瘤细胞对泛 RAF 抑制的敏感性比 KRAS 突变的细胞高，与 BRAFV600E 细胞的敏感性相当。NRAS 突变型黑色素瘤的不同敏感性需要进一步探索，以确定这种敏感性是由于黑色素瘤的内在属性、突变的 NRAS 还是 61 号密码子突变的生化特性。
由于 MEK 或 RAF 抑制剂的单药治疗未能为 KRAS 突变的肿瘤提供临床益处，目前正在临床上探索这些抑制剂联合使用的疗效。由于 MAPK 途径内反馈回路的复杂性，靶向该途径的多个节点可能导致持续和持久地抑制磷酸化 ERK（衡量激活的 ERK 和 MEK 的直接目标；磷酸化 ERK 通常用于衡量整个 MAPK 途径的活性）。事实上，MEK 和 RAF 抑制剂的组合在 RAS 突变型肿瘤细胞的临床前模型中表现出协同作用，并阻止了通路的重新激活。此外，MEK 抑制剂治疗时诱导磷酸化的 MEK 和 GTP 结合的 RAS 是 MEK 和 RAF 联合治疗的协同效应的必要条件。在具有高水平内在核苷酸交换活性的 KRAS 突变的细胞中，如 KRAS-G13D，观察到 MEK 和 RAF 抑制的最强协同效应，这增强了 GTP 结合的 RAS 水平：这一观察表明，由 MEK 抑制诱导的 RAF 二聚化可能有助于这种协同效应。目前，两项结合 RAF 和 MEK 抑制剂的 I 期临床试验正在进行中。一项是调查 belvarafenib 和考比替尼的组合（NCT03284502；表 2），另一项是调查 trametinib 和 LXH-254 的组合（NCT02974725；表 2）。
MAPK 通路：ERK 抑制剂。抑制 ERK（该级联中的终末激酶）可直接减少致癌转录输出，并为对 MEK 或 RAF 抑制有抵抗力的肿瘤提供宝贵的新治疗选择。ERK 抑制剂的临床开发滞后于 MEK、BRAF 单体和泛 RAF 抑制剂的开发。此外，ERK 抑制剂治疗 RAS 突变型肿瘤的早期临床试验基本失败了（图 1）。
临床前化合物 SCH-772984（图 1）通过与 ERK1/2 结合和抑制 ERK1/2，同时诱导构象转变，防止 ERK1/2 被上游激酶磷酸化，从而起到双重机制 ERK 抑制剂的作用。用 SCH-772984 处理 RAS 突变的癌细胞系，可降低磷酸化的 ERK 水平，减少细胞增殖。默克公司开发的临床化合物 MK-8353 与 SCH-772984 相比具有更好的药代动力学特性（图 1）。与 SCH-772984 类似，MK-8353 作为一种双机制抑制剂，在临床前模型中减少了 NRAS 突变黑色素瘤细胞系的细胞增殖。然而，在 MK-8353 的 I 期单药临床试验中，在入组的 26 名 KRAS 或 NRAS 突变的患者中没有观察到抗肿瘤反应。但是，在 BRAFV600 突变的黑色素瘤患者中观察到了三个 PR。MK-8353 正在与司美替尼（NCT03745989；表 2）和帕博利珠单抗（NCT02972034；表 2）联合进行临床评估，其中包括 RAS 突变肿瘤患者。
GDC-0944（一种 ERK 抑制剂，图 1）与 cobimetinib 联合使用在 KRAS 突变型肿瘤模型中表现出治疗效果。尽管临床前异种移植模型显示这种治疗方案可以达到导致生长减少的治疗剂量，但由于患者不能耐受这种组合，科比替尼和 GDC-0994 的 I 期临床试验被终止。
然而，当 GDC-0994 作为单药治疗被评估时，在一项 I 期临床试验中，推荐的 II 期剂量为每天 400 毫克，21 天一疗程 / 7 天一疗程，病人是可以忍受的。在试验中，14 名 BRAF 突变型 CRC 或胃癌患者接受了 GDC-0094 的治疗，2 名患者获得了 PR，7 名患者获得了 SD，5 名患者疾病进展。在入选的 14 名 KRAS 突变肿瘤患者中，有 4 人获得 SD，10 人疾病进展。使用 NanoString 基因表达法，GDC-0994 在配对的肿瘤活检中诱发了 MAPK 途径的抑制（19-51%），在 BRAF 突变的 CRC 患者中（四人中有三人）比在 KRAS 突变的 PDAC 患者中（四人中有一人）观察到更大的抑制作用。由于只有一名患者在每天 100 毫克的低剂量下接受了评估，因此需要在第二阶段研究中对 NRAS 突变的肿瘤进行进一步评估。
在最近完成的一项 I 期临床试验中，Ulixertinib（BVD-523；图 1）对 NRAS 突变的黑色素瘤和 BRAF 突变的实体瘤显示出抗肿瘤效果。Ulixertinib 是一种选择性的、可逆的、ATP 竞争性的 ERK1/2 抑制剂。在试验中，17 名 NRAS 突变黑色素瘤患者接受了 Ulixertinib 的治疗，3 名患者（18%）获得了 PR，6 名患者获得了 SD，8 名患者疾病进展。尽管这些结果对 NRAS - 突变型黑色素瘤来说是令人鼓舞的，但试验表明 ulixertinib 可能对 KRAS 突变型肿瘤不起作用。由于 NRAS 突变的肿瘤对 MEK 和泛 RAF 抑制剂的反应历来好于 KRAS 突变的肿瘤，因此应继续对 KRAS 突变的肿瘤进行评估。目前正在评估 Ulixertinib 与化疗、纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇（nab-paclitaxel）和吉西他滨联合治疗转移性 PDAC 患者的 I 期临床试验（NCT02608229；表 2）。
KO-947（图 1），目前正处于针对 RAS 突变型和 BRAF 突变型 NSCLC 的 I 期临床试验中，并在临床前模型中有效降低了磷酸化 ERK 的水平（NCT03051035；表 1）。观察到持续的反应；在体外单次用药后，磷酸化 ERK 的水平可以被抑制长达 5 天。这些特性与所讨论的其他 ERK 抑制剂不同，表明 KO-947 可能提供的治疗优势。然而，患者可能对这种磷酸化 ERK 的持续抑制不耐受。
LY-3214996（图 1）目前正在进行 I 期临床试验，它是 ERK1 和 ERK2 的体外水平有效和选择性抑制剂（IC50 = 5 nM）（NCT02857270；表 1）。在剂量升级组中，33 名 RAS 突变型和 16 名 BRAF 突变型肿瘤患者接受了 LY-3214996 治疗。七名 BRAF 突变的患者肿瘤消退，两名患者出现 SD，而一名 RAS 突变的肿瘤患者出现 SD；其他患者疾病进展。
总的来说，单药 MEK、RAF 或 ERK 抑制剂在治疗 RAS 突变型肿瘤方面的疗效甚微。因此，这些抑制剂必须与 MAPK 途径的其他抑制剂或本综述中讨论的其他方法联合使用。为每种类型的抑制剂找到最佳组合将是一个挑战。然而，等位基因特异性 RAS 抑制剂的出现，增加了可用于达到最大抑制效果的潜在组合的数量。
Pi3K 通路抑制剂。在所有的 RAS 效应器中，靶向 MAPK 途径一直是抑制 RAS 突变肿瘤的主要关注点。然而，RAS 的第二个效应途径，即 PI3K，也被 RAS 激活。接下来的章节将更详细地描述 PI3K 抑制剂的类型以及这些抑制剂治疗 RAS 驱动的肿瘤的疗效。
有三类（I-III）的 PI3Ks。第一类 PI3Ks 在被 GTP 结合的 RAS 激活后，磷酸化磷脂酰肌醇 4,5 - 二磷酸酯（PIP2），生成磷脂酰肌醇（3,4,5）- 三磷酸酯（PIP3），将 AKT 招募到膜上并使其激活 mTOR。I 类 PI3Ks 通常由一个异质二聚体组成，包括一个催化亚基 p110（包含一个 RBD）和一个调节亚基 p85。三个基因（PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD 和 PIK3CG）分别编码四个 p110 亚单位的异构体 --p110α、p110β、p110γ 和 p110δ170。p110α 和 p110β 异构体是泛在表达的，而 p110γ 和 p110δ 一般只在免疫细胞中表达。p110β 和 p110γ 异构体可以被 G 蛋白偶联受体和受体酪氨酸激酶激活。癌症通过 PIK3CA 的激活性突变、AKT 的扩增或 PTEN 的丢失来上调 PI3K 通路，PTEN 编码一种将 PIP3 转换为 PIP2 的末端磷酸酶。有趣的是，PI3K 通路突变可与 RAS 突变共存，而 RAS 突变和 MAPK 通路突变则相互排斥，如 EGFR 或 BRAF。这表明，RAS 突变足以使 MAPK 失调，而不是 PI3K 通路失调。PI3K 途径的激活，可以在化疗或 MAPK 抑制的情况下发生，从而对这两种疗法产生抗性。此外，这表明联合抑制 MAPK 和 PI3K 对治疗 RAS 驱动的肿瘤可能是有效的。
我们在此讨论了 p110α 抑制剂，因为 p110α 是广泛表达的，并且只被 RAS 激活，与 p110γ 和 p110δ 不同。四种 I 类 PI3K 抑制剂已获得 FDA 批准，其中一种是阿培利司，是 p110α 特异性的，另一种是 库潘尼西，是泛 I 类 PI3K（图 1）。然而，这些抑制剂没有被批准用于治疗 RAS 突变的肿瘤。
RAS 同时激活 PI3K 和 MAPK 途径，并且有重叠的反馈机制提供两条途径的串联。抑制一种途径可导致另一种途径的代偿性激活；因此，同时抑制 MAPK 和 PI3K 是一种吸引人的策略。临床前模型表明，联合抑制 PI3K 和 MEK 对治疗 RAS 突变的肿瘤是有效的，并且可以在临床上实现。然而，在临床试验中，这些抑制剂的组合不能被耐受，疗效不大，可能是由于其毒性导致的用药剂量减少。
为了克服这种毒性，研究的重点转变为确定能够抑制 PI3K、MAPK 或两者途径的受体酪氨酸激酶。一个这样的受体，胰岛素样生长因子 1 受体（IGF1R），是突变 RAS 介导的 PI3K 的激活所必需。IGF1R 和 MEK 的联合抑制在 CRC 和 NSCLC 模型中有效地发挥了协同作用。此外，在与 IGF1R 抑制剂林西替尼的组合中，用 KRAS-G12C 共价抑制剂取代 MEK 抑制剂，改善了这种组合在小鼠模型中的疗效和耐受性。IGF1R 和 KRAS-G12C 共价抑制剂组合的疗效和耐受性需要在将来的临床环境中进行评估。
目前没有任何 AKT 抑制剂被批准用于临床，不管是 RAS 突变的肿瘤还是其他肿瘤。AKT 和 MEK 抑制剂的组合正在进行临床评估，但已经有报告称，其毒性问题与 PI3K-MAPK 抑制剂研究中观察到的相似。mTOR 抑制剂（everolimus 或 temsirolimus）与 MEK 抑制剂（trametinib 或 pimasertib）的组合耐受性也比较差（图 1）。最近一篇关于针对 PI3K 途径的评论详细介绍了 AKT 和 mTOR 抑制剂的临床状况。
由于组织类型决定了 p110 异构体的表达以及 RAS 或 PI3K 突变的普遍性，需要进一步研究以确定组合方法的最佳设置。同种型特异性 p110 抑制剂预计会有较少的脱靶效应和更小的毒性，因为它们应该更有针对性地针对恶性细胞。由于 p110δ/p110γ 抑制剂已被批准用于治疗慢性淋巴细胞性白血病和小淋巴细胞性淋巴瘤，因为这些异构体只在白细胞中表达，因此使用这些抑制剂可能对治疗 RAS 驱动的白血病有效果。PI3K 疗法也应与本评论中讨论的其他方法相结合进行评估，如等位基因特异性抑制剂，包括 KRAS-G12C 的抑制剂。
# 新兴的治疗方案
# 小干扰 RNA 疗法
在小鼠模型中，含有 KRAS 靶向性小干扰 RNA（siRNA）的纳米颗粒递送系统的研究表明，些种方式可能是靶向 KRAS 的有效方法，并且可能是突变特异性的。同时，一种化学修饰的反义寡核苷酸 AZD4785，在临床前模型中皮下注射后能显著降低 KRAS 的水平，但在临床试验中未能充分降低患者的 KRAS 水平（NCT03101839）。目前正在进行的工作是改善吸收和内化，并提高我们对如何使这种方法更有效的理解。一种针对 KRAS-G12D 的突变体特异性 siRNA，siG12D-LODER，在 12 名 PDAC 患者的一期试验中与化疗联合使用，并表现出良好的前景；两名患者获得了 PR，10 名患者获得了 SD（NCT01188785）。正在进行的一项针对 KRASG12D PDAC 患者的 II 期试验将评估 siG12D-LODER 与吉西他滨和纳布 - 紫杉醇的联合应用（NCT01676259；表 2）。
# 靶向自噬
研究发现用 siRNA 或短发夹 RNA 对 KRAS 进行遗传性抑制，或用针对 KRAS-G12C（ARS-853, ARS-1620）、MEK（曲美替尼，考比替尼）或 ERK（SCH772984）的抑制剂对 MAPK 途径进行药物抑制，可增加自噬。PDAC 细胞由于其生长依赖于自噬，因此其自噬水平增加，因为在临床前模型中，自噬的药物抑制或基因耗尽已经诱发了肿瘤的消退。从这些研究中，一项用羟氯喹（FDA 批准用于治疗疟疾）抑制自噬的临床研究在 20 名 PDAC 患者中进行，并显示出有限的活性，因为 20 名患者中有 18 名出现了疾病进展。但使用羟氯喹与化疗（吉西他滨加 nab - 紫杉醇）联合进行术前护理的结果是有希望的，因为这种治疗增加了总生存期，并降低了血液中肿瘤生物标志物碳水化合物抗原 19-9（CA 19-9）的水平。
尽管用羟氯喹治疗 PDAC 的疗效有限，但在 PDAC 和 NRAS 突变黑色素瘤的临床前模型中，羟氯喹和 MAPK 途径的抑制剂的组合显示出有希望的结果。羟氯喹和曲美替尼的联合治疗在异种移植和 PDX 模型中表现出了强大的肿瘤消退效果。用曲美替尼和羟氯喹联合治疗一个对所有标准治疗方案难治的转移性 PDAC 患者，可大大降低 CA 19-9 水平，并诱发 PR，使肿瘤体积减少 50%。有了这个有希望的结果，目前正在评估一项 I 期临床试验，研究曲美替尼加羟氯喹治疗 PDAC 患者的疗效（NCT03825289；表 2）。
# 免疫治疗
免疫检查点抑制剂。肿瘤通过负调节抗原（检查点）逃避免疫系统的检测。广泛讨论的免疫检查点包括细胞毒性 T 淋巴细胞蛋白 4（CTLA4）、PD1 和 PDL1。CTLA4 对 T 细胞的激活进行负向调节。PD1 在 T 细胞上表达，当与 PDL1 结合时产生细胞内抑制信号。肿瘤在细胞表面表达 PDL1，因此这种相互作用抑制了肿瘤附近的免疫活动。
七种针对免疫检查点蛋白的抗体已获得 FDA 批准：一种抗 CTLA4（伊匹单抗），三种抗 PD1（纳武利尤单抗、帕博利珠单抗、西米普利单抗）和三种抗 PDL1（阿特珠单抗、阿维单抗、度伐利尤单抗）抗体。免疫疗法被批准用于治疗 NSCLC 和黑色素瘤，这是四个主要 RAS 突变肿瘤类型中的两个。伊匹单抗目前被批准作为转移性黑色素瘤的单一疗法，作为黑色素瘤的辅助疗法，并与纳武利尤单抗联合用于治疗晚期 NSCLC 和黑色素瘤。抗 PD1 抗体纳武利尤单抗和帕博利珠单抗目前被批准用于治疗不可切除或转移性黑色素瘤，并作为黑色素瘤的辅助治疗（纳武利尤单抗）以及治疗晚期 NSCLC 的手段。抗 PDL1 抗体阿特珠单抗和度伐利尤单抗也被批准用于治疗 NSCLC（NCT02951767, NCT02108652）。目前正在进行临床试验，评估这些抗 PDL1 抗体治疗黑色素瘤的疗效（NCT02535078, NCT01772004）。
高突变负荷、PDL1 的高表达水平和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）数量的增加是对免疫治疗反应的预测。PDAC 和 CRC 的免疫原性很低，因为它们通常有免疫抑制的微环境和低突变负担。因此，免疫疗法对这些肿瘤的治疗效果并不理想。然而，有一部分 PDAC 或 CRC 患者表现出高水平的微卫星不稳定性（MSI-H）或错配修复缺陷（dMMR），因此对免疫疗法有反应；不到 15% 的 CRC 和 20% 的 PDAC 是 MSI-H。鉴于这一成功，帕博利珠单抗被批准用于治疗 MSI-H 实体肿瘤，而纳武利尤单抗被批准用于 MSI-H 或 dMMR CRC。
在 NSCLC 中，对抗 PD1 和抗 PDL1 抗体的临床反应仅限于一部分患者；当作为单药使用时，大约有 10-20% 的患者对这些抗体有临床反应。NSCLC 的突变情况可能决定了对检查点抗体的反应。在 KRAS 突变的 NSCLC 中，LKB1 突变的存在降低了对 PD1 阻断的总体反应率（7.4%），而 TP53 突变相对于仅有 KRAS 突变的肿瘤（28.6%）的反应率更提高（35.7%）。
等位基因特异性 RAS 抑制剂或 MAPK 途径的抑制剂与免疫疗法的联合治疗可以改善 RAS 突变肿瘤对免疫疗法的反应。有趣的是，一项临床试验显示，具有 KRAS 突变的 NSCLC 肿瘤的 PDL1 水平增加，这可能使这些肿瘤具有免疫抵抗力。突变的 KRAS 直接上调 PDL1 的表达；用 MEK 抑制剂（曲美替尼）或选择性的 KRAS-G12C 抑制剂（ARS-853）可以逆转这种上调。此外，在免疫功能正常的小鼠模型中，用 AMG 510 治疗会诱发促炎症的肿瘤微环境，TILs 数量增加，而且该药与抗 PD1 治疗有协同作用。同时，正在进行 NSCLC 中 AMG 510 和抗 PD1 或抗 PDL1 联合治疗 II 期临床试验（NCT03600883；表 2）。抑制 MEK 也能增加 TILs 的数量，当与抗 PDL1 治疗相结合时，能协同诱导肿瘤的消退。事实上，有一项 II 期临床试验正在调查阿特唑单抗和科比米尼联合治疗 NSCLC 的疗效（NCT03600701；表 2），尽管这种组合在转移性 CRC 中没有提供临床益处。此外，一项 I 期临床试验目前正在评估斯巴达珠单抗（一种抗 PD1 抗体）与 TNO155（一种 SHP2 抑制剂）的组合（NCT04000529；表 2）。
T 细胞输入疗法。治疗 RAS 驱动的癌症的第二种免疫治疗方法涉及工程免疫系统，以识别突变 RAS 蛋白的特定抗原。这种方法使用采用细胞疗法，将在体外扩增的 T 细胞（TILs 或转基因 T 细胞）转移到患者体内。TILs 能识别肿瘤上显示的特定抗原，将扩增的 TILs 转移到患者身上能使黑色素瘤患者获益。工程化 T 细胞受体（TCRs）并在外周血淋巴细胞中表达的技术发展实现了类似的临床效益，并允许将这一技术扩展到单个病人之外。
鉴于黑色素瘤中肿瘤特异性抗原的成功鉴定，我们用类似的方法来鉴定 KRAS 突变体特异性抗原。从一个转移性 CRC 患者身上，发现了能特异性识别 KRAS-G12D 的 CD8+TILs，在输注扩大的 TILs 后，该患者七个肺部转移病灶的肿瘤消退，持久的 PR 持续了 9 个月。另一项研究在一位 NSCLC 患者的 CD4+T 细胞中发现了 KRAS-G12V 突变的特异性 TCR。这些研究表明，KRAS-G12D 或 KRAS-G12V 的抗原在人类中具有免疫原性。
因此，上述这些抗原可以被用来设计 T 细胞。Wang 等人用突变的 RAS 肽免疫带有人类白细胞抗原转基因的小鼠，HLA-A*11:01，以产生识别这些突变的 T 细胞。小鼠 T 细胞的 TCR 被鉴定、克隆并逆转录到外周血淋巴细胞中，使 T 细胞对 RAS-G12D 或 RAS-G12V 抗原产生反应。在异种移植模型中，这些工程小鼠 T 细胞特异性监测到人类 KRAS 突变的 PDAC 细胞，导致肿瘤减少或完全消退。目前，有两项临床试验正在使用这项技术，在 HLA-A*11:01 的患者中，用针对 RAS-G12D 或 RAS-G12V 的小鼠 TCR 转导人类外周血淋巴细胞（NCT03745326, NCT03190941；表 1）。
癌症疫苗。治疗 RAS 突变体肿瘤的第三种免疫治疗方法是利用已知的 RAS 突变体肿瘤抗原，通过疫苗接种引起 T 细胞反应。其中一种方法是将突变的 RAS 蛋白的肽与粒细胞 - 巨噬细胞结肠刺激因子（GM-CSF）结合起来进行皮内注射。这种刺激激活了树突状细胞并引发了针对突变肽的 T 细胞反应。在一项针对 PDAC 患者的 I/II 期临床试验中，使用突变 RAS 特异性疫苗 Targovax TG-01 治疗，患者的免疫反应增强，总生存率提高（NCT02261714）。第二代疫苗 TG-02 已被用于治疗 CRC 患者，但结果尚未公布（NCT02933944）。
第二种方法是使用一种编码常见 KRAS 突变（G12C、G12D、G12V 和 G13D）的新表位的 mRNA。通过肌肉注射一种脂质纳米颗粒配制的 mRNA 疫苗，mRNA 纳米颗粒被抗原呈递细胞吸收，翻译并呈现在细胞表面，并导致了 T 细胞对突变的 RAS 新表位的反应。目前正在进行一项 I 期临床试验，评估一种这样的 mRNA 疫苗 mRNA-5671，用于 KRAS 突变的患者，其中 mRNA 可作为单药或与帕博利珠单抗联合使用（NCT03948763；表 1，2）。
# 总结及未来方向
KRAS-G12C 等位基因特异性抑制剂将改变 RAS 驱动的肿瘤的治疗前景。这些抑制剂有望成为 FDA 批准的首个治疗 RAS 突变肿瘤的药物，并将用于治疗由突变 RAS 驱动的难治性癌症，如 PDAC、CRC 和 LUAD。尽管这些抑制剂的开发是令人印象深刻的，但新的挑战和问题也将出现。
将继续开发针对其他等位基因的抑制剂，如 KRAS-G12D 和 KRAS-G12V。这些等位基因是最常见的 KRAS 变异体，因此关联着最庞大的患者群体。最后，可以开发出针对所有突变 RAS 等位基因的特异性抑制剂，提供一种个性化的医学方法。瞄准突变的 RAS 蛋白是治疗 RAS 突变肿瘤的最佳方法；然而，等位基因特异性抑制剂作为单一疗法的疗效可能有限。最大的抗肿瘤效果可能需要与其他抑制剂联合使用。
由于如下几个原因，确定哪种组合策略对患者的效果最好将是一个挑战。首先，RAS 的每种变异都有不同的生化特性，这些特性将决定对所讨论的许多治疗方法的反应。例如，使用 RMC-4550 对 SHP2 的抑制对治疗 KRASG12 变异的细胞有效，并且对 KRASG12C 比对 KRASG12D 或 KRASG12V 更有效。这一研究表明，SHP2 和 KRAS-G12C 抑制剂的组合将是一种有效的治疗策略。了解特定突变 RAS 密码子的要求和抑制剂对这些等位基因的反应，在开发联合疗法策略时将是必要的。
其次，正如本综述所讨论的那样，肿瘤类型可以极大地影响反应率。RAS 突变的 CRC 和 PDAC 对 MAPK 抑制剂或免疫检查点阻断的反应很小。AMG 510 试验的早期数据显示，CRC 比 LUAD 更难治疗，这表明 CRC 将需要联合治疗 。CRC 肿瘤的治疗尤其具有挑战性。然而，用比尼米尼、恩戈拉非尼和西妥昔单抗的三联疗法治疗能够在 BRAFV600E 转移性 CRC 中观察到有希望的抗肿瘤效果，表明 KRAS 突变的 CRC 将需要积极的联合策略以获得治疗反应。
第三，从历史上看，联合治疗有毒性，安全性差。然而，用 AMG 510 观察到的剂量限制性的毒性是令人鼓舞的，说明突变体特异性疗法仅具有有限的脱靶效应。等位基因特异性抑制剂（毒性低）可以与其他毒性较大的抑制剂联合使用，而不会遇到联合使用两种有毒化合物所观察到的问题，就像 PI3K 和 MEK 抑制剂的联合使用那样。
随着 RAS 驱动的肿瘤治疗变得更加个性化，需要对等位基因特异性抑制的潜在耐药机制进行评估。肿瘤的异质性可以提供内在的抗性机制。例如，一个肿瘤可能包含 95% 的 KRASG12C 和 0.1% 的 KRASG12V 细胞。用等位基因特异性的 KRAS-G12C 抑制剂治疗后，肿瘤会消退，但最终 KRASG12V 细胞会被选中，肿瘤会复发。肿瘤的异质性也可导致内在抗性，因为细胞亚群对 KRAS-G12C 抑制有抗性。临床前模型没有考虑到肿瘤的异质性，临床上的反应将阐明这种影响。同时，目前关于用 KRAS-G12C 等位基因特异性抑制剂治疗后会出现哪些新的突变类型的证据很少。
已描述的 EGFR 和 BRAF-V600 抑制剂的耐药性机制可以说明我们在临床上可能会看到等位基因特异性 KRAS-G12C 抑制剂出现哪些新的突变。半胱氨酸突变是一种预期的耐药机制，因为已经发现共价 EGFR 抑制剂；同时，在 KRAS-G12C 的情况下，半胱氨酸突变是致癌活性所必需的，因此，除非该残基突变为另一个致癌的 KRAS-G12 突变等位基因（如天冬氨酸、缬氨酸或其他残基），否则临床上不太可能观察到。基因扩增，其中包括 BRAF 或 RAS，已被描述为对 BRAF-V600 抑制剂的一种耐药机制，MET 扩增也已在 EGFR 抑制剂中被观察到。在这种情况下，EGFR 或另一上游 EGFR 家族成员的扩增可促使细胞中 GTP 结合的 RAS 水平升高，从而对 KRAS-G12C 抑制剂产生抗性，因为这些分子与 GDP 结合的形式结合。此外，RAS 扩增，无论是 HRAS 还是 NRAS，或 KRAS 本身的扩增，都有可能驱动 RAS 二聚化和 GTP 结合的 RAS 水平升高，从而对 KRAS-G12C 抑制剂产生耐药性。BRAF 突变肿瘤的大多数获得性耐药机制是重新激活 MAPK 途径，除了上述机制外，还可以通过 NRAS 和 MEK1/2 的突变实现。因此，MAPK 途径的重新激活提出了许多可想而知的对等位基因特异性抑制剂的耐药机制，可以通过改变上游信号（通过 EGFR 突变或扩增或 RAS 扩增），或下游机制，如 RAF 或 MEK 突变来实现。表皮生长因子的重新激活也可以通过自分泌和 / 或旁分泌机制发生，如分泌原肝素结合的 EGF 样生长因子。
细胞状态的变化，如从 NSCLC 转为 SCLC 或黑色素瘤中主要的调控因子 MITF 的上调，已经被描述为对 EGFR 和 BRAF-V600 抑制剂的耐药机制。此外，上皮 - 间质转化的重新编程与 NSCLC 的 EGFR 抑制剂的耐药性和黑色素瘤的 BRAF-V600 的抑制有关。当然，对 KRAS-G12C 抑制剂耐药的转录机制可能最终使肿瘤细胞状态与突变的 KRAS 无关。这些抗性机制中的每一个都可能需要新的组合治疗方法，以实现对 RAS 驱动的肿瘤更全面和持久的抑制。
使 RAS 的 GTP 酶活性失效的突变是另一种设想的抗性机制。与这一假设一致地，CRISPR 筛选显示，NF1 的缺失会促进耐药性。重要的是，NF1 的缺失会使 BRAFV600E 肿瘤对威罗非尼治疗产生抗性，这表明 RAS 突变的肿瘤可能利用类似的方法来产生抗性。此外，当阻断 GTP 酶活性的突变（A59G）与 KRAS-G12C 同时引入时，由于 KRAS-G12C 主要处于 GTP 结合状态，会使等位基因特异性 KRAS-G12C 抑制剂的效果减弱。然而，目前还不清楚这些预测的机制在不同的 RAS 突变或肿瘤类型中是否一致。
这是一个令人振奋的时代，因为 RAS 突变的癌症可以得到成功的治疗，这是一个令人振奋的时刻，因为我们可以站在 "对无法治疗的癌症进行药物治疗" 的最前沿。
