前言：MAPK 通路是癌症中最常发生突变的致癌通路之一。尽管 RAS 突变是最常见的 MAPK 改变，但该途径下游（包括 RAF 和 MEK 基因）中不太常见的突变提供了有希望的治疗机会。
# 摘要
MAPK 通路是癌症中最常发生突变的致癌通路之一。尽管 RAS 突变是最常见的 MAPK 改变，但该途径下游（包括 RAF 和 MEK 基因）中不太常见的突变提供了有希望的治疗机会。除了 BRAFV600 突变（有几种已获批准的治疗方案）外，RAF 和 MEK 基因的其他突变可能提供更多罕见的、但可利用的靶标。然而，最近的研究已经证明了 MAPK 信号通路的复杂性，并强调这些基因的不同突变可能具有惊人的不同特性。了解本文所回顾的特定 RAF 和 MEK 突变的独特功能特征，对于开发这些目标的有效治疗方法至关重要。
本文要点：RAF 和 MEK 基因的突变是多种癌症类型中很有前途的治疗靶点。然而，鉴于 MAPK 通路独特而复杂的信号生物学，在癌症中观察到的各种 RAF 和 MEK 改变可能具有不同的功能特点。正如本综述所概述的，了解不同 RAF 和 MEK 的突变的关键功能特征是选择最佳治疗方法的基础。
# 前言
MAPK 信号通路参与了许多重要的细胞过程的关键节点。它的失调将导致不受控制的细胞增殖、生存和细胞去分化。因此，在大多数癌症中，MAPK 通路会被改变或不适当地激活。
在生理条件下，MAPK 信号是被激活的 RAS 蛋白（KRAS、NRAS 和 HRAS）触发的，RAS 蛋白是一个小型鸟嘌呤三磷酸酶（GTP 酶）家族，整合来自各种上游来源的信号，最常见的是来自激活的受体酪氨酸激酶（RTK）。这些上游信号导致鸟嘌呤核苷酸交换因子的激活，如 SOS，催化了 RAS 结合的二磷酸鸟嘌呤（GDP）与三磷酸鸟嘌呤（GTP）的交换。RAS 的活性受到 GTP 酶激活蛋白的负向调节，如神经纤维素 1（NF1），它增强了 RAS 的 GTP 酶活性，将 GTP 水解为 GDP，从而使 RAS 恢复到其无活性的 GDP 结合状态。在其活跃的 GTP 结合状态下，RAS 的开关 I 和 II 区发生了构象变化，促进了与各种下游效应物的相互作用，包括 RAF 家族的激酶（ARAF、BRAF 和 CRAF，后者由 RAF1 基因编码）. RAF 蛋白通过其保守的 RAS 结合域与激活的 RAS 联合，导致形成具有激活的 RAF 激酶活性的 RAF 同源二聚体（即 CRAF-CRAF）或异源二聚体（即 BRAF-CRAF）。例如，在结合激活的 RAS 之前，BRAF 处于自抑制构象，其中其激活环中的短 α 螺旋与激酶域中的关键 αC 螺旋结合并置换成非活性 "外" 状态。BRAF 二聚体和激活环的磷酸化破坏了这种自抑性相互作用的稳定性，使 BRAF 激酶进入螺旋 "αC-in" 活性构象。一旦被激活，RAF 激酶会磷酸化并激活 MEK 激酶（MEK1 和 MEK2，分别由 MAP2K1 和 MAP2K2 基因编码），后者又会磷酸化并激活 ERK 激酶（ERK1 和 ERK2）。被激活的 ERK 激酶随后磷酸化一系列关键的底物，以此调节关键的细胞过程。
鉴于 MAPK 通路信号的许多重要作用，该通路的激活受到严格的控制。有几个层次的负反馈控制，限制了 MAPK 信号的生理性激活。例如，DUSPs 作为 ERK 的负反馈回路通过直接抑制 CRAF 和 BRAF 的磷酸化以及诱导多种 MAPK 磷酸酶的表达。ERK 还通过磷酸化 SOS 和各种 RTKs 以及诱导 Sprouty 家族蛋白成员的表达来抑制 RTKs 对 RAS 的激活。这些反馈信号调节了该途径内致癌性的输出，通过影响该途径每一级的复发性致癌性改变的谱系，从而对靶向治疗反应性和耐药性产生影响。
MAPK 通路中基因组改变的频率随着通路下游的进一步发展而降低：在人类肿瘤中，RAS 突变占 22%，BRAF 占 7%，MEK 占 < 1%，而 ERK 突变则异常罕见。途径上游的改变（如 RAS 突变）所产生的 ERK 激活程度往往容易受到负反馈信号的制约，而那些进一步的下游突变则可以摆脱负反馈调节，并能导致通路更深层次的激活。在甲状腺乳头状癌中，对碘化物运输有重要作用的 ERK 反应基因的表达可以很容易地进行检测，在 BRAFV600E 突变体（强烈激活）和 RAS 突变体（较少激活）之间可以看到 ERK 反应基因的表达差异。
RAS 突变是迄今为止在人类癌症中观察到的最常见的 MAPK 改变，RAS 信号传导和针对 RAS 的策略已在其他地方被广泛综述。这篇综述的重点是 MAPK 通路的下游改变，包括 RAF 和 MEK 基因的突变。鉴于该途径独特的信号生物学特性，最近的研究表明，MAPK 途径的下游改变可大致分为两种类型：激活型和扩增型。"激活型" 的突变通过独立于上游通路活动的 ERK 激活导致组成性的 MAPK 通路的信号传导。相反，"扩增型" 的改变依赖于上游活动，并增强了 ERK 的下游信号。激活型突变强烈地激活 ERK，并且通常相互排斥，而扩展型突变通常与通路上游的其他激活型突变共同出现。有趣的是，激活型突变的发生率在通路的下游逐渐减少，而扩增型突变的比例逐渐增加；通路下游成分的激活型改变，如 MEK 或 ERK，将导致非常高的通路输出水平，因为它们逃避了反馈信号，因此可能具有选择性的弱点。了解特定 RAF 和 MEK 突变的独特信号特性是设计克服它们的策略的关键。在此，我们总结了我们目前对 RAF 和 MEK 多种突变的理解，以及它们对信号传导、靶向治疗反应和耐药性的影响。在这个机制框架的基础上，我们概述了针对这些特定改变的合理策略。
图 1
# RAF 的不同突变
BRAF 是迄今为止 RAS 下游 MAPK 通路中最经常突变的基因，在所有癌症中的突变率在 7% 到 10%。点突变是 BRAF 最常见的改变方式，但在一些癌症中也可观察到基因融合和框内缺失。最近的研究表明，BRAF 的不同突变可以产生一系列功能不同的变体，并具有明显不同的信号传导特性。由于 RAF 蛋白通常需要与 RAS 相互作用以实现其二聚化和随后的激活，因此功能变异的核心是由突变体如何改变这种相互作用所驱动。每个特定的突变如何影响 RAF 二聚体的形成和功能，对于理解每个改变的功能后果和针对每个变体所需的不同策略至关重要。总的来说，BRAF 改变可被描述为三个一般的功能类别，其中 I 类和 II 类突变体构成 "激活器"，III 类突变体代表 "扩增器"。
# I 类 BRAF 突变：不依赖 RAS 的激酶激活而作为单体信号
迄今为止，I 类 BRAF 突变仅包括 BRAFV600 突变，它占癌症中观察到的 BRAF 改变的 90% 以上。50% 以上的黑色素瘤、40% 以上的甲状腺乳头状癌和 10% 以上的结直肠癌都有 BRAFV600 突变。BRAFV600E 是最常见的氨基酸替换突变，占 BRAFV600 突变的 90% 以上，尽管有时也会观察到缬氨酸 -600 替换为其他氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸。此外，这些突变还能在肺癌和结直肠癌对 EGFR 抑制剂的获得性耐药时被检测到。BRAFV600 突变的独特之处在于它们产生了一个组成型活性的 BRAF 激酶，能够作为单体进行信号传递。BRAFV600 突变导致 BRAF 激酶活性高，磷酸化和激活的 ERK 水平高。BRAFV600 突变激活 MAPK 信号的能力与 RAS 活性无关。事实上，由于激活的 ERK 下游有强大的负反馈信号，RAS 活性水平在 BRAFV600 突变的细胞中被发现处于抑制状态。
# II 类 BRAF 突变：RAS 非依赖性激酶激活，作为二聚体传递信号
非 V600 BRAF 突变体可根据其信号传导特性和对 RAS 激活的依赖性分为两组。第一组是 II 类激活突变体，包括 K601E、L597Q 和 G469A。大多数 BRAF 融合和 BRAF 框内缺失（下文讨论）也具有第二类突变的许多特征。这些变体作为独立于 RAS 激活的构成性激活的突变体二聚体发出信号；它们不需要 RAS 激活来进行二聚。在这些突变体中，ERK 的高度激活上调了对 RAS 激活的反馈抑制，而且这些突变体通常不与其他 MAPK 通路改变同时出现。在 EGFR 突变的非小细胞肺癌患者中，II 类 BRAF 突变已被确定为对 EGFR 抑制剂的获得性耐药机制。
# III 类 BRAF 突变：激酶受损的，RAS 依赖的二聚体信号
相反的，III 类突变体，包括 D594 和 G466 突变体，其 BRAF 激酶活性受损，通过突变体 / 野生型 RAF 异质体放大信号，增加 ERK 信号传导。因此，III 类 BRAF 突变体的异常信号传导依赖于与野生型 RAF 原形体的异质化。第三类突变体比野生型 BRAF 与 RAS 结合得更紧密，并表现出野生型 CRAF 的结合和激活增强。因此，有这些突变体的肿瘤中 ERK 的激活需要上游 RAS 的激活。因此，这些突变发生在具有高 RTK 活性的肿瘤中，并导致 RAS 的激活，经常与激活的 RAS 或 NF1 功能缺失的突变同时出现。这些并发突变的频率因起源组织而异；在黑色素瘤中，内源性基底 RAS 活性较低，这些突变体几乎总是与突变的 NF1 或 RAS 共存，而在结直肠癌和肺癌中，其基底 RTK 活性较高，由此产生的 RAS 活性足以支持这些突变体的激活，只有少数病例与 RAS/NF1 突变共存。在 RAS 或 NF1 没有同时发生基因组改变的情况下，具有这些突变体的肿瘤的生长对驱动 RAS 活性的主导 RTK 的抑制很敏感。因此，受损的 BRAF 突变体与结直肠癌的生存率的提高和对 EGFR 抑制剂的敏感性增加有关，与激活型 BRAF 突变如 V600E 形成鲜明对比，后者与低生存率和对 EGFR 抑制剂缺乏反应有关。
图 2
# BRAF 融合和框内删除
最近，在一些癌症中，包括 0.5% 至 1% 的胰腺癌和甲状腺癌，BRAF 的 β3-αC 区域靠近 P 环的重复性框内缺失被确定为低频率的缺失。这些改变与其他 MAPK 激活性改变是相互排斥的。事实上，这些改变存在于 5% 的 KRAS 野生型胰腺癌中。这些小的框内缺失导致 β3-αC 环缩短，使 BRAF 激酶的 αC 螺旋处于活性 "in" 构象，最终导致激酶活性增加。这些突变体以活性二聚体的形式发出信号，类似于 II 类 BRAF 的改变。
BRAF 融合在一些癌症中发现，特别是在小儿低度胶质瘤中，包括 50% 以上的皮洛氏星形细胞瘤。它们存在于总 0.3% 的癌症中，并且存在于 3% 至 4% 的黑色素瘤中（富集于 Spitzoid 亚型），以及存在于 0.3% 的胰腺癌中，但富集于 KRAS 野生型胰腺癌和胰岛细胞癌（20% 的病例）。这些重排产生了一个异常的融合产物，将 C 端 BRAF 激酶结构域与 N 端二聚化结构域相连接。这导致构成性二聚化和 BRAF 激酶活性的激活，而不依赖于 RAS 或其他上游信号。
# RAF 基因中的非 BRAF 改变
ARAF 和 CRAF 的突变极为罕见，但除 BRAF 外，RAF 基因的一些激活性突变也有报道。在一些癌症中观察到 RAF1 融合，通常导致（很像 BRAF 融合）C 端 CRAF 激酶结构域与 N 端融合的异常基因产物，其二聚结构域导致 RAS 无关的二聚化并激活 CRAF 激酶活性。这些融合在低级别的小儿胶质瘤、前列腺癌、黑色素瘤和胰腺癌中发现。
图 3
# MEK 的突变
与 RAS 和 BRAF 相比，MEK 突变发生在热点位点，影响 MEK1 或 MEK2 的改变可以分别发生在整个 MAP2K1 或 MAP2K2 基因。Gao 等人最近阐明了许多复发性 MEK1 突变体的功能，他们认为这些突变体在功能上可分为三类。不依赖 RAF 的、RAF 调节的和 RAF 依赖的。
# 不依赖 RAF 的 MEK 突变
这类不依赖 RAF 的突变强烈地激活 MEK 和 ERK，并不受上游信号的影响。这组突变体通常在 98 到 104 个氨基酸的范围内有框内缺失，这些氨基酸去除了 MEK1 的一个有效的负调节区域。该区域与 MEK 激酶结构域中类似的 β3-αC 环相对应，导致一个缩短的环，将激酶限制在活性 "αC-in" 构象中。这个负调控结构域的缺失促使位于 218 和 222 位的激活丝氨酸残基发生自体磷酸化，并使 MEK 激酶活性明显增加。事实上，这些 MEK1 突变体的表达可以在 "无 RAF" 细胞中驱动强烈的 MAPK 信号和细胞转化 -- 这些细胞带有条件性 ARAF、BRAF 和 CRAF（RAF1）等位基因，可以通过 CRE 重组酶删除，证实它们与 RAF 活性无关。这些突变体在人类癌症中发现的频率不高（<0.1%），而且到目前为止没有与其他致癌 MAPK 改变共同出现。因此，与 RAF 无关的 MEK 突变可作为强大的 "激活器" 发挥作用。
# 受 RAF 调节的 MEK 突变
RAF 调节的突变体表现出 ERK 激活的一些基础性增加，但在有激活的 RAF 存在的情况下可以进一步激活信号传导。事实上，相对于野生型 MEK1，RAF 调节的 MEK1 突变体在 "无 RAF" 的细胞中仍能产生一些 ERK 磷酸化的增加，但 ERK 磷酸化的水平大大低于存在功能性 RAF 的情况下，不足以驱动细胞转化，这与 RAF 无关的 MEK1 突变体不同。此外，MEK1 上关键的激活 RAF 磷酸化位点（S218A 和 S222A）的突变也会降低活性，但不会消除这些突变体的 MEK 激酶活性。这些突变体对 ERK 表现出一定范围内的基础活性。因为这些突变体的激酶活性可以在激活的 RAF 存在下进一步增加，RAF 调节的突变体可以与其他激活的 MAPK 改变共同出现。值得注意的是，这些突变体在患者样本中被观察到在对上游抑制剂获得性耐药时出现。例如，MEK1K57 突变体已在对 EGFR 抗体有获得性耐药的结直肠癌患者中被发现，MEK1K57 和 MEK1F53L 突变体已在对 RAF/MEK 和 / 或 EGFR 抑制剂组合有获得性耐药的 BRAFV600E 结直肠癌患者中被发现。因此，RAF 调节的 MEK 突变具有 "激活子" 和 "扩增子" 的特性。
# 依赖 RAF 的 MEK 突变
最后，RAF 依赖性突变体只在 RAF 活跃的情况下增加 ERK 的激活；它们与 RAF 结合得更紧密，增强了 ERK 的激活。事实上，这些突变体在无 RAF 的细胞中不会导致 ERK 的磷酸化，也不能驱动转化。同样，MEK1 上关键的激活 RAF 的磷酸化位点（S218A 和 S222A）的突变在这些突变体中废除了 MEK 激酶活性。因此，这些突变体对 RAF 的反馈抑制特别敏感，这限制了它们的功能性输出，并且几乎普遍与上游 MAPK 的改变，如 BRAF 或 RAS 突变共同出现。因此，这些突变体充当了 RAF 信号的放大因子。
# MAPK 信号通路的抑制剂
目前批准的 RAF 抑制剂可选择性地抑制 RAF 单体（即 I 类，BRAFV600 突变体）。尽管这些抑制剂，如 vemurafenib、dabrafenib 和 encorafenib，经常被称为 "BRAF 抑制剂"，但事实上它们对 BRAF 不具有选择性，能够以类似的效力抑制 ARAF 和 CRAF。然而，这些抑制剂对 BRAFV600 突变型癌症的疗效是由于抑制了 BRAF 突变型细胞中存在并具有活性的单体 BRAF。事实上，这些抑制剂在缺乏 BRAFV600 突变的细胞中的作用是不同和复杂的。这些药物与 RAF 二聚体对中的一个单体结合会导致另一个单体的构象转变，同时降低药物对另一个质体的亲和力。这些抑制剂在 αC 螺旋的非活性构象中与 RAF 结合；药物的结合使第一个单体稳定在这一非活性构象中，并使伙伴单体转变为 "内" 的活性构象，产生结构阻碍，药物不能与之结合。因此，抑制剂与 RAF 二聚体中的一个质体结合，实际上可以通过二聚体中的质体的反激活而导致 RAF 信号的矛盾激活。需要更高剂量的 RAF 抑制剂来克服这种负合作性，并与二聚体中的两个 RAF 原形体结合，以完全阻断 RAF 二聚体的信号传导，而这在患者中是无法实现的。因此，这些药物对 RAF 是以二聚体形式发出信号的肿瘤是无效的。
新一类的 RAF 抑制剂与 RAF 单体抑制剂的选择性不同。与野生型 BRAF 相比，所有的 RAF 抑制剂对 BRAFV600E 都有一定程度的优先抑制，因为 BRAFV600E 的 ATP 结合亲和力比野生型 BRAF 弱。较新的一类 RAF 抑制剂被描述为 "RAF 二聚体抑制剂"，在同等剂量下与 RAF 二聚体中的两个部位结合。这些药物应该具有治疗指数，因为它们对突变体 RAF 二聚体和单体的抑制效力大于对野生型二聚体的抑制效力，因此在正常细胞中对 MAPK 信号的抑制程度不一样。从机制上讲，这些 RAF 抑制剂有望抑制具有突变 RAF 二聚体的肿瘤，包括非 V600 BRAF 激活突变体和 BRAFV600 肿瘤，这些肿瘤通过基因组改变，如 RAS 突变 / 扩增、BRAFV600E 扩增或 BRAF 的基因内缺失或剪接变体，导致 BRAFV600 二聚体化，从而对 RAF 抑制剂产生抗性。在 RAF 野生型细胞中不诱发矛盾的 ERK 激活的下一代 RAF 抑制剂也已被开发出来，这些药物（如 PLX8394）通常被称为 "矛盾破坏者"，目前正处于 I 期研究。这些药物通过特异性地破坏含有 BRAF 的二聚体，包括 BRAF-BRAF 同源二聚体和 BRAF 异源二聚体来抑制信号传导。这些药物对 CRAF 同源二聚体或含 ARAF 的二聚体无效，可能是由于位于 RAF 激酶结构域 N 端的氨基酸残基导致这些二聚体中二聚体界面的稳定性增强。RAF 二聚体抑制剂在不同的 RAF 同种型之间显示出较少的选择性，因此即使在上游 RAS 强烈激活的细胞中也能抑制 RAF 信号传导。由于这些抑制剂可能抑制正常细胞和肿瘤细胞中的 MAPK 信号，这些药物的治疗窗口可能比 "RAF 二聚体破坏者" 更窄。在二聚体抑制剂 LY3009120 的 I 期试验中，有一个有限的剂量升级，该药的最大耐受剂量对肿瘤磷酸化 ERK 水平和 ERK 靶基因的表达影响很小。然而，参与这项试验的大多数病人的肿瘤都有 RAS 突变，而不是 RAF 改变。
图 4
# MEK 抑制剂
大多数 MEK 抑制剂，如 selumetinib 和 FDA 批准的三种药物 --trametinib, cobimetinib, 和 binimetinib，都是异生激酶抑制剂。这些化合物与 MEK 催化位点附近的异生口袋结合，导致构象变化，限制了 MEK 的激酶活性。具体来说，药物结合使 MEK 采取 "封闭" 构象，并导致一系列构象变化，使一个高度保守的谷氨酸残基（Glu114）从活性部位移开，从而使其无法与保守的催化赖氨酸残基（Lys97）形成关键离子对。异生型 MEK 抑制剂有一些明显的优势 -- 因为它们与 MEK 上一个独特的异生型口袋结合，而不是与催化位点结合，后者与其他激酶有更高的同源性，这些抑制剂对 MEK 有高度的特异性，因此不太可能驱动非目标毒性。然而，异生型 MEK 抑制剂也有关键的弱点。特别是，许多异生型 MEK 抑制剂在上游 MAPK 信号增加的情况下表现出抑制 MEK 激酶活性的能力下降，导致 MEK 的激活增加。这可能是通过两种潜在机制的融合而发生的。首先，许多 MEK 抑制剂优先与 MEK 的非活性形式结合，当 MEK 处于磷酸化和活化形式时，可能表现出与 MEK 的结合亲和力下降。因此，如果上游信号转导增加导致磷酸化和活化的 MEK 水平增加，抑制剂结合和抑制 MEK 的能力可能会降低。第二，上游 MAPK 信号的明显增加可导致激活的 MEK 水平超过最大 ERK 诱导所需的水平。因此，需要更大比例的 MEK 抑制来降低 MEK 活性的绝对水平，使之转化为 ERK 磷酸化的减少，相对于基准条件，需要更大浓度的抑制剂。
# ERK 抑制剂
近些年，ERK 的直接抑制剂也已经被开发出来，并已进入早期临床测试。一些 ERK 抑制剂，如 SCH772984，通过导致 ERK 激酶活性降低，来 MEK 介导的 ERK 磷酸化减少（至少在一段时间内）。其他 ERK 抑制剂，如 ulixertinib（BVD-523）及其结构相关的化合物 Vx-11e，抑制 ERK 激酶活性，但导致负反馈驱动的 MEK 介导的 ERK 磷酸化明显增加。由于这个原因，ERK 磷酸化不是衡量 ERK 抑制剂有效性的可靠标准，检测 ERK 活性的下游标志物，如 ERK 底物的磷酸化，如 p90RSK，或 ERK 调节的转录物的水平，如 DUSP6，才能更可靠的评判抑制剂的效果。
值得注意的是，对 ERK 抑制剂的初步研究表明，相对于 MEK 抑制剂，这些抑制剂不太容易因上游信号的增加而导致 MAPK 通路的重新激活。事实上，一些研究表明，即使在存在上游抗性改变的情况下，ERK 抑制剂也能更好地维持对 MAPK 输出的抑制，这些抗性改变在 MEK 抑制剂存在的情况下驱动 MAPK 重新激活，因为 MEK 抑制剂与 MEK 活性构象的结合减少，ERK 依赖性转录的丧失导致 ERK 磷酸酶（DUSP 蛋白）水平下降，或 MEK 激活 "过量"，正如上所述地，削弱了 MEK 抑制剂的效果。由于 ERK 抑制剂直接阻断 ERK 活性，它们不太容易受到 MEK 活性构象的增加、ERK 磷酸酶的减少或 MEK 活性水平过剩的影响。临床前数据表明，ERK 水平的改变，如扩增或突变，可能能够导致对这些抑制剂的耐药性。虽然还需要进一步研究，但这种较新的 MAPK 抑制剂可能成为针对 MAPK 通路改变的癌症的治疗手段的关键部分。
# 靶向 RAF 和 MEK 的突变
对来自 BRAFV600 癌症患者临床试验的配对治疗前和治疗中的肿瘤活检的药效学分析显示，临床反应需要对 MAPK 信号的深度抑制。事实上，维莫非尼用于 BRAFV600 黑色素瘤的早期临床试验的药效学研究表明，要获得治疗反应需要对 ERK 活性进行》80% 的抑制。因此，针对有 MAPK 改变的癌症的一个首要目标是产生强大和持续的 MAPK 通路抑制。特别的，必须仔细考虑 MAPK 通路抑制剂的治疗指数，无论是单独使用还是联合使用，以便在患者可达到的药物浓度下实现强大的通路抑制。事实上，了解信号生物学的关键特征，识别和拦截肿瘤细胞可能维持 MAPK 输出的机制，对于设计有效的治疗策略至关重要。
# RAF 突变
# I 类 BRAF 突变（BRAFV600）
迄今为止，RAF 单体抑制剂 -- 包括 FDA 批准的三种药物 vemurafenib、dabrafenib 和 encorafenib-- 一直是针对 BRAFV600 突变型癌症的治疗策略的核心。这些药物表现出相对较宽的治疗窗口，这是因为 BRAFV600 肿瘤细胞中的作用不同，BRAF 以单体形式出现，而正常细胞则以二聚体形式出现。ERK 信号在正常组织中的矛盾激活是这些药物导致增殖性皮肤病变（如角化棘皮瘤）发生的原因，这一原因也支持将 RAF 抑制剂与 MEK 抑制剂相结合的治疗方案。RAF 和 MEK 抑制剂对皮肤中 ERK 激活的对立作用削弱了联合使用的皮肤毒性，并减少了这些增殖性皮肤病变的发生率。
然而，不完全的通路抑制或通路重新激活是 RAF 抑制剂面临的一个主要难题。RAF 抑制剂治疗后，RTK 信号传导从反馈抑制中释放出来，导致快速产生耐 RAF 抑制剂的 RAF 二聚体，并导致对 RAF 抑制剂的适应性抵抗。联合使用 RAF 和 MEK 抑制剂可以提高疗效，因为 MEK 的抑制可以抑制由此产生的 ERK 再激活。适应性耐药性在具有高基础 RTK 信号的组织中最为明显。在结直肠癌中，EGFR 信号的重新激活已被证明限制了 RAF 抑制剂的活性，而 EGFR 抑制剂与 RAF 或 RAF/MEK 抑制剂的组合表现出更高的疗效。
在接受高风险 BRAFV600 黑色素瘤切除手术的患者中，联合 RAF 和 MEK 抑制剂已被证明可以降低复发风险，因此这种方案似乎能够根除一些患者的微转移。然而，在转移的情况下，几乎所有的病人最终都会对 RAF 抑制剂的治疗产生抗性。耐药性通常是由增加 RAF 二聚体的改变介导的，如 RAS 突变或扩增、BRAFV600 扩增、BRAF 的剪接变体或 RTK 信号的增加，或较少见的增加 ERK 激活的 MEK 的突变。尽管有 MEK 抑制剂治疗，但出现了重新激活 ERK 信号的改变，这表明将 RAF 抑制剂与目前的 MEK 抑制剂联合使用可能不是最佳选择。最近的数据表明，ERK 抑制剂可能产生更好的对 ERK 信号的抑制，并有能力克服普遍观察到的获得性耐药。新一代 RAF 抑制剂（可能与 MEK 或 ERK 抑制剂联合使用）是否会在 BRAFV600 肿瘤的治疗中发挥关键作用仍需要进一步的临床研究：一个关键问题是这些组合的治疗指数。虽然 MEK 和 ERK 抑制剂的组合被证明具有毒性，目前仍正在进行 RAF 和 ERK 组合的首次研究（NCT02974725）。
# II 类 BRAF 突变
与 I 类 BRAF 突变不同，II 类突变对 RAF 单体抑制剂（如 vemurafenib）不敏感。因为这些药物在临床上可达到的剂量下，只与二聚体对中的一个原形体结合，所以在这些变异体中，它们不会对 ERK 信号传导产生实质性的抑制，因为这些信号传导由激活的突变二聚体组成。然而，由于突变的 BRAF 二聚体已经完全激活，而且 RAF 抑制剂与二聚体中的第一个质体结合不会导致另一个质体的转导，因此 RAF 单体抑制剂导致这些突变体中磷酸化的 ERK 受到适度抑制。
一种针对 II 类突变的替代性临床策略涉及使用较新的 RAF 抑制剂，其功能为 RAF 二聚体抑制剂或 RAF 二聚体破坏者。这些抑制剂可以破坏活跃的 BRAF 二聚体的信号传导，并能在这些模型中抑制 MAPK 信号传导。由于新一代的 RAF 抑制剂最近才进入临床，目前还不清楚这些药物是否能在具有 II 类 BRAF 突变的肿瘤中取得临床反应。
第二种潜在策略涉及阻断 II 类 BRAF 突变下游的 MAPK 信号。事实上，MEK 抑制剂在 II 类 BRAF 突变的临床前模型中保持了抑制 MAPK 信号的能力，但这种方法的临床经验有限。同样，ERK 抑制剂代表了在这种情况下对下游 MAPK 阻断的另一种方法。最近 ERK1/2 激酶抑制剂 ulixertinib 的试验招募了 28 名非 V600 BRAF 突变体的患者。激活的非 V600 BRAF 突变体患者出现了反应，包括 BRAFL597Q 肺癌、BRAFL458W 胆囊癌、BRAFG469A 头颈癌和 BRAFG469A 小肠癌。总的来说，33%（15 人中的 5 人）的 II 类 BRAF 突变患者对 ulixertinib 达到部分反应。有趣的是，在 10 名具有 III 类 BRAF 突变的患者中没有观察到反应。虽然还需要进一步的临床研究，但这些早期数据表明，对 MAPK 信号的下游抑制可能是一些携带 II 类 BRAF 突变的癌症的有效临床策略，而在具有高度 RAS 激活的 III 类 BRAF 突变的细胞中，反馈再激活会削弱这种方法的疗效。
# III 类 BRAF 突变
同样，III 类 BRAF 突变也对 RAF 单体抑制剂（如 vemurafenib）不敏感。这些突变体以突变 BRAF/ 野生型 RAF 二聚体的形式发出信号，RAF 抑制剂与二聚体中的突变 BRAF 结合导致野生型 RAF 的转录激活。因此，在存在这些突变的情况下，RAF 单体抑制剂无法抑制 MAPK 信号的传递。
MAPK 信号的下游抑制剂（即 MEK 和 ERK 抑制剂）在存在 III 类突变的情况下保留了抑制 MAPK 信号的能力。然而，目前还不清楚 MAPK 信号的下游抑制是否足以实现临床肿瘤反应，或者是否需要对肿瘤中的 RTK 信号进行联动。如上所述，没有携带 III 类 BRAF 突变的患者对 ERK 抑制剂 ulixertinib 有反应，可能是因为这些肿瘤中的 RAS 高度活化削弱了 ERK 抑制剂的效果。
因此，对于具有 III 类 BRAF 突变的肿瘤，一个有希望的策略是针对上游信号，而 III 类突变则是一个 "放大器"。这在具有野生型 RAS 和主导 RTK 信号的肿瘤中最容易实现。例如，具有 III 类 BRAF 突变的结直肠癌与抗 EGFR 抗体的敏感性提高和生存率改善有关。因此，针对优势 RTK 可能代表了一种有效的、可操作的 III 类突变肿瘤的策略。由于肿瘤并不总是只接受单一的优势 RTK，而可能接受来自多个 RTK 的信号，因此阻断上游信号的另一种方法是使用 SHP2 抑制剂，它可以阻断多个 RTK 使用的一个关键的共同效应靶点。SHP2 抑制剂最近已进入临床。最后，针对下游 ERK 激活（即使用 MEK 或 ERK 抑制剂）和上游信号传导（即使用 RTK 或 SHP2 抑制剂）的联合治疗方法可能代表了对携带这些突变的癌症的潜在治疗策略。
# RAF 融合以及激活型框内删除
BRAF 和 CRAF（RAF1）融合主要导致 C 端 RAF 激酶结构域与具有二聚结构域的 N 端伙伴融合，导致构成性 RAS 无关的二聚化和激活 RAF 激酶活性。因此，RAF 单体抑制剂对 BRAF 或 CRAF 的融合无效。事实上，RAF 单体抑制剂可以诱导 BRAF 和 CRAF 融合构建体的矛盾激活，可能是通过二聚体伙伴的转导激活，类似于在激活 RAS 的情况下观察到的野生型 RAF 二聚体。"矛盾破坏者"RAF 抑制剂，如 PLX8394，不会导致 BRAF 融合体的矛盾激活，并能抑制激酶活性 -- 可能是通过破坏 BRAF 二聚体。然而，PLX8394 不能抑制 CRAF 融合二聚体的信号，实际上在这种情况下会导致 CRAF 信号的矛盾激活。然而，一些 RAF 二聚体抑制剂在临床前模型中可以破坏 BRAF 和 CRAF 融合的信号传导。因此，RAF 二聚体抑制剂值得在这种情况下进一步探索。
此外，MEK 抑制剂的下游阻断作用在多个案例报告中观察到了成功的迹象。事实上，MEK 抑制剂曲美替尼在治疗携带 BRAF 融合的黑色素瘤患者已观察到临床反应。用 ERK 抑制剂抑制下游 MAPK 也值得考虑用于 BRAF 融合的肿瘤中。
同样，BRAF 在 β3-αC 环的框内缺失也产生了活化的 BRAF 激酶，对 RAF 单体抑制剂不敏感。特别是 RAF 抑制剂，如 vemurafenib-- 它们优先结合非活性的 "αC-out" 构象 -- 对这些突变体的结合力减弱，它们被限制在活性 "αC-in" 构象中。然而，RAF 二聚体抑制剂和能与 "αC-in" 构象结合的 RAF 抑制剂在这些模型中保持疗效。此外，用 MEK（或 ERK）抑制剂进行下游抑制可以有效抑制这些变体驱动的 MAPK 信号。事实上，最近的一份报告详细介绍了一位 KRAS 野生型胰腺癌患者，他的 β3-αC 环中存在 BRAF 内框缺失，用曲美替尼治疗后取得了临床反应。有趣的是，当该患者对曲美替尼产生获得性耐药时，在无细胞 DNA（cfDNA）中检测到三个 MEK2 突变的出现，表明该癌症高度依赖 MAPK 信号，并通过通路的重新激活而产生耐药性。值得注意的是，随后用 ERK 抑制剂治疗导致这些 MEK2 突变在 cfDNA 中的水平急剧下降。因此，尽管显然需要进一步的临床经验，但这些数据支持用 MEK 或 ERK 抑制剂对下游进行抑制，作为一种有希望的策略来治疗带有这些突变的癌症。
# MEK 突变
不同的 MEK 突变体对目前批准的 MEK 抑制剂表现出不同的敏感性，这些抑制剂都是异生的 MEK 抑制剂。然而，所有的 MEK 突变体似乎对一类新的与催化部位结合的 ATP 竞争性 MEK 激酶抑制剂或 ERK 抑制剂保持敏感。这些数据表明，在临床上针对具有突变 MEK 的肿瘤的努力需要考虑到 ERK 的激活机制。
# 不依赖 RAF 的 MEK 突变
不依赖 RAF 的突变对异构 MEK 抑制剂不敏感，如曲美替尼、科比美替尼、比美替尼和塞鲁米替尼，因为这些药物优先与 MEK1 的失活的 "αC-out" 构象结合。这些 MEK 变体中的 β3-αC 环的短框缺失将激酶限制在活性的 "αC-in" 构象中，减少了异构 MEK 抑制剂的结合亲和力。然而，这些突变保留了对较新的与催化部位结合的 ATP 竞争性 MEK 抑制剂的敏感性。这些突变还保留了对 ERK 抑制剂的下游抑制的敏感性。
# 收到 RAF 调控的 MEK 突变
临床前研究表明，RAF 调控的 MEK 突变可能保留对 MEK 抑制剂的敏感性，因为这些抑制剂可以抑制携带这些突变体的临床前模型中的 MAPK 信号。事实上，有传闻说某些 RAF 调节的 MEK 突变（即 MEK1K57 突变）可能对 MEK 抑制剂表现出临床反应性。事实上，在一位 RAS 野生型结直肠癌患者中，在对抗 EGFR 抗体西妥昔单抗长期反应后，出现了 MEK1K57T 突变作为获得性耐药的机制，在抗 EGFR 治疗中加入 MEK 抑制剂曲美替尼后，携带 MEK1K57T 突变的肿瘤病灶出现了消退，序列 cfDNA 中 MEK1K57T 的可检测变异等位基因频率明显下降。
然而，也有临床证据表明，MEK 抑制剂可能无法克服 RAF 调节的 MEK 突变。事实上，在 BRAFV600 黑色素瘤和结直肠癌中，已经观察到其中几个突变出现在对 RAF 和 MEK 抑制剂联合治疗的获得性耐药中。由于这些变异体的活性可以通过增加 RAF 介导的磷酸化而增强，因此适应性反馈信号可能会使 MEK 抑制剂在持续的上游信号传导的情况下变得不那么有效。
作为一种替代方法，ERK 抑制剂可能是克服这些改变的一种有希望的策略。临床前研究表明，ERK 抑制剂在存在这些 MEK 突变的情况下仍有疗效。最近的一项研究表明，RAF 和 MEK 抑制剂组合不能抑制携带 MEK1K57 和 MEK1F53 突变的 BRAFV600 结直肠癌细胞的生长，但 ERK 抑制剂单独或 RAF 和 ERK 抑制剂组合可以完全抑制其生长。因此，ERK 抑制剂代表了针对这些改变的一类有希望的药物。
# RAF 依赖的 MEK 突变
MEK 和 ERK 抑制剂保留了抑制这类 MEK 突变驱动的 MAPK 信号的能力，因此代表了这种情况下的一种潜在治疗策略。然而，这些 MEK 改变作为 "放大器"，在大多数情况下与上游激活性改变（通常是 BRAFV600 突变）并存。因此，针对主导的上游信号与 MEK 或 ERK 的下游阻断相结合，可能是一种最佳的方法。例如，在 BRAFV600 癌症中，RAF 抑制剂与 MEK 或 ERK 抑制剂的组合可能是最佳的治疗选择。
图 5
# 总结
MAPK 途径在人类癌症中起着关键作用，并通过各种不同的机制在很大一部分癌症中被不适当地激活。然而，由于 MAPK 途径的复杂信号生物学，下游途径成分的不同改变，如 RAF 和 MEK，可以有极大的不同的信号特性。近年来，详尽的生物化学和功能研究是阐明 MAPK 信号传导的重要细微差别的关键，为治疗策略的发展创造了关键基于。同时，未来针对 RAF 或 MEK 改变的新策略的临床试验应包括仔细的药效学评估，通过配对的治疗前和治疗中的肿瘤活检，以确定每种疗法对其目标的具体信号传导作用。总的来说，详细了解特定 RAF 和 MEK 改变的独特信号特征，对指导有效疗法的设计至关重要。
