标题翻译：基因工程的蛋白质定位 - 转录报告系统在联合高通量 CRISPRi 筛选中确定了线粒体和 ER 膜蛋白转运的调节器
解析要点：作者得细胞定位报告工具的构建
# 摘要
# 原文翻译
在正确的时间将特定的蛋白质群运送到正确的亚细胞位置，对于生物学中的每一个信号和调节过程都都是至关重要的。基因沉默筛选可以提供一个强大的方法来探究蛋白质转运的分子机制，但前提是蛋白质的定位或错误定位可以与细胞表型联系起来，并可以被例如细胞增殖或荧光激活细胞分选（FACS）的方法筛选。为了加强对基因沉默的蛋白质转运过程的研究，我们开发了一种基因编码的分子工具，名为 HiLITR （高通量定位指示器与转录读出）。 HiLITR 能够将蛋白质的共定位转化为膜锚定转录因子的水解释放，从而驱动所选报告基因的表达。使用 HiLITR 与基于 FACS 的 CRISPRi 人类细胞系筛选相结合，我们确定了影响线粒体和 ER 尾锚蛋白的转运的基因。我们表明，SUMO E1 成分 SAE1 的缺失会导致许多线粒体尾锚蛋白的错误定位和性质不稳定。我们还证明了 EMC10 在 ER 膜复合物中的独特调节作用：阻止复合物的跨膜域插入活动。通过对复杂细胞功能的转录整合， HiLITR 扩大了通过遗传沉默筛选技术研究的生物过程的范围。
# 解读
通过摘要我们可以得出：
- 作者开发了一个工具
HiLITR，能够研究蛋白质的亚细胞水平的（共）定位 - 作者想要筛选出影响蛋白质亚细胞定位的基因
- 传统的基因沉默筛选（如 CRISPRi 筛选）具有局限性：在研究蛋白质的亚细胞定位方面，只有这个错误定位能够反应到表型上，才能被检测到（运用 FACS 方法分选细胞表型） —— 意味着某个基因的沉默只有影响到表型才能检测到，但是如果对表型的影响不大，则难以被检测
HiLITR作为一个共定位工具与 CRISPRi 相结合弥补了上述的不足，它通过将蛋白的共定位现象转化为报告基因信号，使得蛋白的定位变化能够在细胞表型上反映出来- 作者通过
HiLITR+ FACS/CRISPRi，确定了一些调控线粒体和内质网的蛋白定位的基因
# 小知识
CRISPRi 筛选是一种高通量的基因筛选方法，通过在大量的细胞中随机敲除基因并测定表型变化，并对分选的细胞进行深度测序，找到调控这个表型变化的基因。
推荐阅读： High-content CRISPR screening. Nat Rev Method Prim.
# 结果
# HiLITR 原理
- 作者需要一种机制把活细胞中的蛋白定位错误转化为可以被检测到的信号。
- 作者通过一个蛋白酶（GFP-TEVP）和一个转录因子（TF），当蛋白酶和转录因子能够共定位于同一个细胞器，则转录因子被切下来，启动报告基因的转录（使细胞产生能够被检测的表型）
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# HiLITR 和 CRISPRi 联用筛选影响蛋白质亚细胞定位的基因
- 作者可以编辑
HiLITR的两个成员的定位信号使其定位在不同的细胞器上 - CRISPRi 如果敲除了促进这种亚细胞定位的基因，则蛋白酶和 TF 的共定位减少，报告基因的表达活性减弱；反之敲除了抑制这种定位的基因，则报告基因的活性将会增强
- 报告基因的活性变化能够被 FACS 检测并分选，通过对分选细胞 sgRNA 测序即可鉴定每个细胞中被敲除的基因。
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- 作者设计了一些不同的定位系统
- 组 1：TF 为 TA 的线粒体定位方式，蛋白酶为 SA 的定位方式
- 组 2：TF、蛋白酶都为 TA 的线粒体定位方式
- 组 3：TF 定位于内质网；蛋白酶的 TA 序列突变，会错误的定位在内质网上，当导向线粒体的蛋白被敲除，内质网的蛋白酶水平会随之增多
- 以上三种系统在（调控线粒体定位的蛋白）无被敲除、调控 TA 的定位被敲除、调控 SA 的定位被敲除的时候有着不同的报告基因反应（如图）
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# 小知识
SA、TA 都为线粒体的定位结构，受到不同的蛋白质调节。
# 数据分析
对三种系统 + CRISPRi 联用，作图、取交集、看筛选出来的基因。
筛选到了这么多的基因能够影响蛋白的定位。
# 进一步鉴定 SAE1 能够正向调节线粒体定位
- 敲除 SAE1 以后组 1 的报告基因活性降低，组 3 的活性升高（联合说明其促进 TA 的线粒体定位，敲除以后蛋白酶在线粒体上的定位减少，内质网定位增加）
- 敲除 SAE1 以后对一些含有 TA 的线粒体定位蛋白的定位检测
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# 进一步鉴定 EMC10 能够负向调节内质网定位
- EMC 的其他成员被鉴定出来能够促进蛋白酶的 ER 定位（敲除后显示低的报告基因活性，说明敲除后蛋白酶的内质网定位减少）
- 然而 EMC10 被鉴定出来与其他成员有相反的作用（敲除后显示高的报告基因活性）
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# 总结
作者开发了一个工具克服了 CRISPRi 的缺陷用来探索影响亚细胞定位的基因。并鉴定了 SAE1 能够正向调节线粒体定位；EMC10 能够与其他家族成员不同地，负向调节内质网定位。
