实验操作 | CoIP

引言：以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

# 原理

• 蛋白间相互作用是细胞各种基本功能的主要完成者，参与几乎所有的重要生命活动。因此，蛋白 - 蛋白相互作用研究以及建立相互作用的关系网络图，具有十分重要的意义，也是目前蛋白质研究领域的热点。
• Co-IP（免疫共沉淀， co-inmunoprecipitation ）是经典的利用抗体从样品中捕获靶蛋白及其互作蛋白、复合体的一项技术，能够特异性富集所研究的目的蛋白。由于过程中采用了非变性条件，保留了互作及复合体的细胞内状态。相对于酵母双杂交、 pull down 等方法，其特色之一便是捕获的蛋白互作发生在所研究的特定组织细胞内，保存了互作蛋白及复合体的 “内源” 状态。
• 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质 - 蛋白质相互作用被保留了下来，假如细胞内存在 XY 蛋白复合物，用 X（X 也称为诱饵蛋白）的抗体免疫沉淀 X，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y（Y 也称为靶蛋白）也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白 X，随后利用 蛋白免疫印迹 （ western blot ， WB ）检测沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，则说明细胞内存在 XY 蛋白复合物，即蛋白 XY 存在相互作用。

CoIP 原理示意图

• CoIP 的优势：
  1. 取材可以选择该目的蛋白所在物种、特定组织、细胞，因此 CoIP 能够反应该蛋白在天然组织细胞状态下存在的互作关系蛋白；
  2. 找出整个复合体中直接 / 间接互作的多个蛋白，研究复合体组成；
  3. 通过与质谱鉴定连用可以初筛到一系列未知蛋白，再通过其他技术进一步验证。

前言：以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

# 操作

# 一般流程

免疫共沉淀实验流程为：收集蛋白样品 — 诱饵蛋白抗体沉淀诱饵蛋白 —SDS-PAGE 分离蛋白 —WB 检测是否存在靶蛋白。

# 收集蛋白样品

蛋白样品通常通过裂解细胞得到。CoIP 实验通常有两种，一种为内源性蛋白相互作用验证，另外一种为非内源性蛋白相互作用验证，内源性相互作用是指两蛋白相互作用在细胞内发生，即通过质粒共转染的方式将两种蛋白转染至同一细胞内表达，表达完成后收集细胞进行裂解得到蛋白样品。非内源性相互作用两蛋白相互作用在细胞外发生，即将含有靶蛋白的动植物组织、器官进行预处理及细胞裂解获得细胞裂解液，随后将诱饵蛋白（通常为重组表达纯化获得）加入细胞裂解液中，得到蛋白样品。

# 沉淀诱饵蛋白

利用磁珠偶联抗体沉淀诱饵蛋白：在样品中加入磁珠偶联抗体，抗体会与诱饵蛋白结合，利用磁铁将磁珠拉下，同时诱饵蛋白会一起被沉淀出来。如果存在与诱饵蛋白的相互作用的靶蛋白，也会被沉淀下来。如果没有诱饵蛋白的特异性抗体，可以给诱饵蛋白加上标签（Myc、HA、Flag 等），然后利用标签抗体沉淀蛋白。

# SDS-PAGE 及 WB 检测

得到沉淀后，需要验证沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用 SDS-PAGE 将蛋白复合物分离，随后利用 WB 检测是否存在靶蛋白（如果靶蛋白的分子量是已知的，可以直接用 SDS-PAGE 检测是否存在靶蛋白）。

# （重点！）实验对照设置

为了确保最终得到的结果是天然状态下的相互作用，而不是由于某些方面造成的人工相互作用（也就是 “假阳性”），在 CoIP 的实验设计过程中，需要设置正确的对照。
假设 CoIP 实验的实验组为 “ 磁珠 + 抗 X 抗体 + 靶蛋白 X + 目的蛋白 Y ”，则可能出现的 “假阳性” 及对应需要设置的实验对照如下表所示：

上述为了避免出现 “假阳性” 的对照称为阴性对照，除此之外 CoIP 实验还会设置一个阳性对照组（ Input 组 ）， Input 组 为直接利用抗体 X（抗体 Y）对细胞裂解液进行 WB 检测，验证细胞裂解液中存在蛋白 X（蛋白 Y）。
在某些 CoIP 实验中，实验人员会把 IP 后的上清分别进行蛋白 X 和蛋白 Y 的 WB 检测，该对照组称为 output 组 。
利用内源性 CoIP 实验为验证两个蛋白是否存在已知作用，如果最终的结果为阳性，则可以证明两个蛋白之间存在相互作用；但如果结果为阴性，无法证明两个蛋白之间不存在相互作用，也有可能是蛋白在细胞内表达量低等原因导致。因此在进行内源性 CoIP 验证两个蛋白是否存在相互作用时，建议先做过表达 CoIP 作为对照。

# 保持结果的真实性

• 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体具有特异性强、可大量生产、易标准化等优点，使用单克隆抗体有助于避免污染的发生；
• 要确保抗体的特异性，如果抗体不能和细胞溶解物中的抗原结合，则不会引起共沉淀反应；
• 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的。

一般流程示意图

# 具体操作

# 一般共沉淀流程

免疫共沉淀操作步骤是将抗体先结合到蛋白 A/G 琼脂糖珠上，然后再与抗原混合。相对其他方法，最终的得率较低，但避免了抗体共洗脱的问题。如果希望获得高纯度的目的蛋白，而不考虑非特异性结合，可以将抗体和蛋白样品在加入蛋白 A/G 琼脂糖珠之前进行混合，这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来，从而可能会对蛋白质印迹法（western blot）检测造成干扰。

# 操作步骤

1. 用预冷的磷酸缓冲液洗涤细胞两次，最后一次吸干磷酸缓冲液；
2. 加入预冷的 RIPA Buffer（1 ml/107 个细胞、10 cm 培养皿或 150 cm2 培养瓶，0.5 ml/5×106 个细胞、6cm 培养皿、75cm2 培养瓶）^[1];
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮离，把悬液转移到干净的 1.5ml EP 管中。并置于低速摇床，4℃缓慢晃动 15min（EP 管插冰上，置水平摇床上）；
4. 4℃，14000rpm 离心 15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；
5. 将 Protein A/G 琼脂糖珠用磷酸缓冲盐溶液洗两遍，用磷酸缓冲盐溶液配制成 50% 的 Protein A/G 琼脂糖珠工作液，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠；
6. 在样品中以每 1ml 中加 100μl 的比例，加入 50% 的 Protein A/G 琼脂糖珠工作液。水平摇床 4℃摇动 10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白；
7. 4℃，14000rpm 离心 15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A/G 琼脂糖珠；
8. 做蛋白标准曲线（Bradford 法），测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1：10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在 - 20℃保存一个月）；
9. 用磷酸缓冲液将总蛋白稀释到 1μg/μl 以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果觉得你的目的蛋白的浓度低了，可以将总蛋白浓度提高到 10μg/μl（假设浓度足够）;
10. 加入一定体积的抗体到 500μl 总蛋白中，抗体的稀释比例因与它有作用的蛋白在不同细胞系中的多少而异；
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 2h；激酶或磷酸酯酶活性分析建议用 2h 室温孵育；
12. 加入 100μl Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2μl 过渡抗体；
13. 14000rpm 瞬时离心 5s，收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的磷酸缓冲盐溶液）洗涤 3 遍（每次加入 800μl），RIPA Buffer 有时候会破坏琼脂糖珠 - 抗原抗体复合物内部的结合，可以使用磷酸缓冲盐溶液；
14. 用 60μl 2× 上样缓冲液将琼脂糖珠 - 抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl 足够上三道）；
15. 以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻 - 20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮 5min 变性；

实验流程示意图

# 通过免疫共沉淀确定未知结合蛋白

该实验的思路为：先通过免疫共沉淀实验，得到结合蛋白，随后的结合蛋白进行测序。

# 操作步骤

1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中；
2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4℃以最大速度离心 15min；
3. 收集上清（约 30 ml）并加入 30 μg 的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物 1 h；
4. 加入 0.9 ml 的琼脂糖蛋白 A 悬液，4℃摇动免疫沉淀物 30 min；
5. 用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗琼脂糖蛋白 A 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次；
6. 吸出混合物的液体部分。加入 800 μl 的 1×SDS 胶加样缓冲液到球珠中，煮沸 4min；
7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中，在 10mA 的恒定电流下电泳过夜；
8. 通过考马斯亮蓝染色观察蛋白质泳带；
9. 从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1ml 50% 乙腈洗两次，每次 3 min；
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再进行电洗脱；
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽进行 Edman 降解测序。

鉴定未知结合蛋白示意图

# 注意事项

1. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP-40 或 Triton- X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定；
2. 不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂；
3. 使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的 IgG 或另一类单抗；兔多克隆抗体：正常兔 IgG;
4. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
5. 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；
6. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

# 实验结果解读示范

一篇顶刊^[2]的 CoIP 实验

1. 术语
   • IP：immunoprecipitation，代表免疫沉淀，富集目的蛋白；
   • IB：immunoblotting，免疫印迹，即 Western Blotting ，显示目的蛋白；
   • Input：阳性对照，就是用 IP 前的样品做 WB (排除假阳性干扰)；
   • Myc、HA 均为蛋白标签。
2. Input 部分，有三张 WB 结果：
   1. IB: Tublin 代表以 Tubulin 抗体（anti-Tubulin）对样本进行 WB 检测（这里图片中 Tublin 应该是笔误，实为 Tubulin，Tubulin 是常用的内参蛋白），条带 1、条带 2 表明两个细胞裂解液样本中均能检测到 Tubulin 蛋白，并且上样水平一致，表明裂解液样本制备没有问题；
   2. IB: HA 代表以 HA 抗体（anti-HA）对样本进行 WB 检测，条带 3 处空白，表示该样本中没有 HA 标记的蛋白，条带 4 表示该样本中存在 HA 标记的蛋白（ARF-WT-HA）；
   3. IB: Myc 代表以 Myc 抗体（anti-Myc）对样本进行 WB 检测，条带 5 和条带 6 表明两个样本中均含有带 Myc 标签的蛋白（myc-Exportin-5）；
3. IP 部分：该实验采用的是 IP: HA ，表明是用 HA 标记的蛋白（ARF-WT-HA）作为诱饵蛋白，使用 HA 抗体（anti-HA）作为诱饵蛋白抗体进行 IP 实验，而靶标蛋白则是带 Myc 标签的蛋白（myc-Exportin-5）。有两张 WB 结果：
   1. IB: HA 同样代表以 HA 抗体（anti-HA）对样本进行 WB 检测
   2. IB: Myc 同样代表以 Myc 抗体（anti-Myc）对样本进行 WB 检测。不同的是，此次检测的样本是经过 IP 处理之后的样本，通过条带 7、8、9、10 我们可以看见，当样本中存在 ARF-WT-HA 蛋白（条带 8）时，通过 CoIP 实验就能将 myc-Exportin-5 蛋白（条带 9）“沉淀” 下来，反之，则不能。

这实验初步证明 ARF-WT-HA 蛋白与 myc-Exportin-5 蛋白之间存在相互作用，但无法确定二者是直接作用，还是间接作用。

# 应用

免疫共沉淀实验可以用于：

• 测定两种目标蛋白质的互作

常规思路：通过一系列功能实验确定某个信号通路，明确通路相关蛋白并进行验证。
文献^[3]中：通过 CoIP-WB 验证诱饵蛋白 CEBPB 和互作蛋白 PGC1α 是否结合，进一步确定 HCP5/miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB 通路在胃癌中的作用。

• 通过质谱筛选某个已知蛋白可能结合蛋白

常规思路：通过组学或其他手段确定某个功能相关蛋白，进一步筛选确定该蛋白作用机理，则可以选择 CoIP-MS.
文献中^[4]：通过 CoIP-MS 实验筛选到差异蛋白 vimentin，CoIP-WB 和 GSTpull-down 等方法进一步确定 P62 与 vimentin 互作。

• 分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物