首页 科研 实验方法

前言：用电镜检查外泌体啦～

# 实验原理

外泌体在 30~300nm 左右，需要透射电子显微镜、扫描电子显微镜或原子力显微镜才能观察到。结合特定的染色（如负染色）可以使外泌体更加可视化。

# 实验目的

观察外泌体结构并示踪特定蛋白。

# 实验步骤[1][2]

# 外泌体的块状制备，切片，染色和成像

  1. 通过以 100,000xg 离心 1.5h，从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体。除去培养上清液，小心地将纯化的外泌体沉淀用 1mL 2.5％ 戊二醛在 0.1M 二甲胂酸钠溶液（pH7.0）中于 4℃固定 1h 。对于 0.1M 二甲胂酸钠，将 4.28g 二甲胂酸溶于 160mL 蒸馏水（DW）中。用 0.1 M HCl 将 pH 调节至 7.4，然后补足用蒸馏水加至 200 毫升
  2. 取出固定剂，在室温下用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗沉淀。每次重复三次，每次持续 10min
  3. 将样品用 1 mL 2％四氧化锇在 4°C 下固定 1h
  4. 取出固定剂，每 10min 用 0.1M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次
  5. 在振荡器上用分级丙酮系列（分别为 50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％）孵育 10min
  6. 取出丙酮，孵育 3：1 丙酮：低粘度包埋混合物溶液 30min 。外泌体颗粒在管中。
  7. 取出培养基，加入 1：1 丙酮：低粘度包埋混合物培养基，然后孵育 30min
  8. 取出培养基，加入 1：3 丙酮：低粘度包埋混合物培养基，然后孵育 30min
  9. 取出培养基并加入 100％低粘度包埋混合物并在室温下孵育过夜
  10. 使用嵌入模具将样品嵌入纯低粘度嵌入混合物中，并在 65℃下烘烤 24h
  11. 通过超薄切片机制备厚度为 60 nm 的切片
  12. 用 2％乙酸双氧铀双染 20min ，并用柠檬酸铅处理 10min
    • 对于雷诺铅溶液，将 1.33g 硝酸铅和 1.76g 柠檬酸钠加入总共 50mL 蒸馏水中
  13. 在 80kV 下观察透射电子显微镜下的栅格
  14. 单击 “获取”，然后在电子显微镜下在 80 kV 下在 CCD 相机系统中单击 “文件” 和 “另存为”。遵循自动设置曝光时间

# 切片和成像的免疫染色

  1. 使用超薄切片机切割 60nm 超薄切片，并收集在镍网格上
  2. 在 50μL0.02M 甘氨酸滴中孵育网格 10min 以淬灭游离醛基
  3. 用 100μLDW 冲洗三次，每次 10min 。在室温下在含有 1％BSA 的 PBS 中孵育 1h
  4. 在 50-100μL 抗 KRS 抗体 24（含有 0.1％BSA 的 PBS 中 1：100）中孵育网格 1h （如有必要，此步骤应为在 4°C 下进行过夜。）
  5. 用五个单独的滴剂（50μL）含有 0.1％BSA 的 PBS 洗涤网格，每次 10min
  6. 将网格转移至第二抗体滴 1h （与含有 0.1％BSA 的 PBS 中的 10nm 金颗粒（1：100）缀合的抗兔 IgG）
  7. 每 10min 用含有 0.1％BSA 的 5 滴独立滴剂（50μL）洗涤网格
  8. 在黑暗条件下用 2％乙酸双氧铀双染 20min ，用 Reynold 枸橼酸铅分别染色 10min
  9. 单击 “获取”，然后在 80 摄像机的 TEM 下，在 CCD 摄像机系统中单击 “文件” 和 “另存为”。曝光时间遵循自动设置

# 负染色

  1. 通过辉光放电器将薄的 formvar / 碳膜涂覆的 200 目铜 EM 网格放电 1min
  2. 用 1 mL 2％多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体 5min
    • 注意：多聚甲醛烟雾有毒。所有工作都应在通风的通风橱中进行
  3. 在网格上加载 5 - 7μL 外泌体悬浮液，孵育 1min 。如果外泌体浓度过高，则稀释浓度为 1/2 - 1/5
  4. 立即用注射器在 EM 网格表面上用～20 滴过滤的 1％ 乙酸双氧铀（UA）溶液染色
  5. 通过将网格边缘与滤纸接触，去除网格上多余的 UA 溶液
  6. 用一滴水快速冲洗网格。该步骤将除去过量的染色溶液。
  7. 用镊子夹住网格，然后用培养皿部分盖住网格，在室温下干燥 10min
  8. 将网格存储在 EM 网格盒中，以便将来通过 80 kV 的 TEM 观察

# 整体用于免疫染色

  1. 将薄的 formvar / 碳膜涂覆的 200 目铜 EM 网格辉光放电 30s
  2. 用 1 mL 2％多聚甲醛（PFA）固定纯化的外泌体 5min 。注意：多聚甲醛烟雾有毒。所有工作都应在通风的通风橱中进行。
  3. 在网格上加载 5 - 7μL 固定的外泌体溶液并孵育 5min 。用 100μL PBS 冲洗三次，每次 10min
  4. 用 50μL 0.05M 甘氨酸处理网格 10min 以淬灭游离的醛基
  5. 将网格转移到一滴封闭缓冲液（含有 1％BSA 的 PBS）中 30min
  6. 用 50-100μL 抗 PD-L1 抗体（在含有 0.1％BSA 的 PBS 中 1：100）孵育网格 1h （如果需要，该步骤应在 4℃下进行过夜）
  7. 用五个单独的滴剂（50μL）含有 0.1％BSA 的 PBS 洗涤网格，每次 10min
  8. 将网格转移至一滴第二抗体 1h 。在含有 0.1％BSA 的 PBS 中以 1：100 稀释的 9-11nm 金颗粒缀合的抗小鼠 IgG
  9. 用含有 0.1％BSA 的 5 滴独立滴剂（50μL）洗涤网格各 10min 。用两个单独的液滴（50μL）DW 洗涤网格
    • 如上节 4 至 8 所述，用 2％乙酸铀酰进行负染色
  10. 将网格存储在 EM 网格盒中，以便将来通过 80 kV 的 TEM 观察

  1. Wan S, Zhang L, Wang S, et al. Molecular Recognition-Based DNA Nanoassemblies on the Surfaces of Nanosized Exosomes. J Am Chem Soc 2017; 139(15): 5289-92. ↩︎

  2. Al-Dossary AA, Bathala P, Caplan JL, Martin-DeLeon PA. Oviductosome-Sperm Membrane Interaction in Cargo Delivery: DETECTION OF FUSION AND UNDERLYING MOLECULAR PLAYERS USING THREE-DIMENSIONAL SUPER-RESOLUTION STRUCTURED ILLUMINATION MICROSCOPY (SR-SIM). The Journal of biological chemistry 2015; 290(29): 17710-23. ↩︎

更新于