前言:用电镜检查外泌体啦~


# 实验原理

外泌体在 30~300nm 左右,需要透射电子显微镜、扫描电子显微镜或原子力显微镜才能观察到。结合特定的染色(如负染色)可以使外泌体更加可视化

# 实验目的

观察外泌体结构并示踪特定蛋白

# 实验步骤[1][2]

# 外泌体的块状制备,切片,染色和成像

  1. 通过以 100,000xg 离心 1.5h,从 HCT116 细胞的培养上清液中沉淀外泌体。除去培养上清液,小心地将纯化的外泌体沉淀用 1mL 2.5% 戊二醛在 0.1M 二甲胂酸钠溶液(pH7.0)中于 4℃固定 1h 。对于 0.1M 二甲胂酸钠,将 4.28g 二甲胂酸溶于 160mL 蒸馏水(DW)中。用 0.1 M HCl 将 pH 调节至 7.4,然后补足用蒸馏水加至 200 毫升
  2. 取出固定剂,在室温下用 1 mL 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗沉淀。每次重复三次,每次持续 10min
  3. 将样品用 1 mL 2%四氧化锇在 4°C 下固定 1h
  4. 取出固定剂,每 10min 用 0.1M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗三次
  5. 在振荡器上用分级丙酮系列(分别为 50%,60%,70%,80%,90%,95%,100%)孵育 10min
  6. 取出丙酮,孵育 3:1 丙酮:低粘度包埋混合物溶液 30min 。外泌体颗粒在管中。
  7. 取出培养基,加入 1:1 丙酮:低粘度包埋混合物培养基,然后孵育 30min
  8. 取出培养基,加入 1:3 丙酮:低粘度包埋混合物培养基,然后孵育 30min
  9. 取出培养基并加入 100%低粘度包埋混合物并在室温下孵育过夜
  10. 使用嵌入模具将样品嵌入纯低粘度嵌入混合物中,并在 65℃下烘烤 24h
  11. 通过超薄切片机制备厚度为 60 nm 的切片
  12. 用 2%乙酸双氧铀双染 20min ,并用柠檬酸铅处理 10min
    • 对于雷诺铅溶液,将 1.33g 硝酸铅和 1.76g 柠檬酸钠加入总共 50mL 蒸馏水中
  13. 在 80kV 下观察透射电子显微镜下的栅格
  14. 单击 “获取”,然后在电子显微镜下在 80 kV 下在 CCD 相机系统中单击 “文件” 和 “另存为”。遵循自动设置曝光时间

# 切片和成像的免疫染色

  1. 使用超薄切片机切割 60nm 超薄切片,并收集在镍网格上
  2. 在 50μL0.02M 甘氨酸滴中孵育网格 10min 以淬灭游离醛基
  3. 用 100μLDW 冲洗三次,每次 10min 。在室温下在含有 1%BSA 的 PBS 中孵育 1h
  4. 在 50-100μL 抗 KRS 抗体 24(含有 0.1%BSA 的 PBS 中 1:100)中孵育网格 1h (如有必要,此步骤应为在 4°C 下进行过夜。)
  5. 用五个单独的滴剂(50μL)含有 0.1%BSA 的 PBS 洗涤网格,每次 10min
  6. 将网格转移至第二抗体滴 1h (与含有 0.1%BSA 的 PBS 中的 10nm 金颗粒(1:100)缀合的抗兔 IgG)
  7. 10min 用含有 0.1%BSA 的 5 滴独立滴剂(50μL)洗涤网格
  8. 在黑暗条件下用 2%乙酸双氧铀双染 20min ,用 Reynold 枸橼酸铅分别染色 10min
  9. 单击 “获取”,然后在 80 摄像机的 TEM 下,在 CCD 摄像机系统中单击 “文件” 和 “另存为”。曝光时间遵循自动设置

# 负染色

  1. 通过辉光放电器将薄的 formvar / 碳膜涂覆的 200 目铜 EM 网格放电 1min
  2. 用 1 mL 2%多聚甲醛(PFA)固定纯化的外泌体 5min
    • 注意:多聚甲醛烟雾有毒。所有工作都应在通风的通风橱中进行
  3. 在网格上加载 5 - 7μL 外泌体悬浮液,孵育 1min 。如果外泌体浓度过高,则稀释浓度为 1/2 - 1/5
  4. 立即用注射器在 EM 网格表面上用~20 滴过滤的 1% 乙酸双氧铀(UA)溶液染色
  5. 通过将网格边缘与滤纸接触,去除网格上多余的 UA 溶液
  6. 用一滴水快速冲洗网格。该步骤将除去过量的染色溶液。
  7. 用镊子夹住网格,然后用培养皿部分盖住网格,在室温下干燥 10min
  8. 将网格存储在 EM 网格盒中,以便将来通过 80 kV 的 TEM 观察

# 整体用于免疫染色

  1. 将薄的 formvar / 碳膜涂覆的 200 目铜 EM 网格辉光放电 30s
  2. 用 1 mL 2%多聚甲醛(PFA)固定纯化的外泌体 5min 。注意:多聚甲醛烟雾有毒。所有工作都应在通风的通风橱中进行。
  3. 在网格上加载 5 - 7μL 固定的外泌体溶液并孵育 5min 。用 100μL PBS 冲洗三次,每次 10min
  4. 用 50μL 0.05M 甘氨酸处理网格 10min 以淬灭游离的醛基
  5. 将网格转移到一滴封闭缓冲液(含有 1%BSA 的 PBS)中 30min
  6. 用 50-100μL 抗 PD-L1 抗体(在含有 0.1%BSA 的 PBS 中 1:100)孵育网格 1h (如果需要,该步骤应在 4℃下进行过夜)
  7. 用五个单独的滴剂(50μL)含有 0.1%BSA 的 PBS 洗涤网格,每次 10min
  8. 将网格转移至一滴第二抗体 1h 。在含有 0.1%BSA 的 PBS 中以 1:100 稀释的 9-11nm 金颗粒缀合的抗小鼠 IgG
  9. 用含有 0.1%BSA 的 5 滴独立滴剂(50μL)洗涤网格各 10min 。用两个单独的液滴(50μL)DW 洗涤网格
    • 如上节 4 至 8 所述,用 2%乙酸铀酰进行负染色
  10. 将网格存储在 EM 网格盒中,以便将来通过 80 kV 的 TEM 观察

  1. Wan S, Zhang L, Wang S, et al. Molecular Recognition-Based DNA Nanoassemblies on the Surfaces of Nanosized Exosomes. J Am Chem Soc 2017; 139(15): 5289-92. ↩︎

  2. Al-Dossary AA, Bathala P, Caplan JL, Martin-DeLeon PA. Oviductosome-Sperm Membrane Interaction in Cargo Delivery: DETECTION OF FUSION AND UNDERLYING MOLECULAR PLAYERS USING THREE-DIMENSIONAL SUPER-RESOLUTION STRUCTURED ILLUMINATION MICROSCOPY (SR-SIM). The Journal of biological chemistry 2015; 290(29): 17710-23. ↩︎

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