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前言：检测组织中 Th1/Th2 细胞的比例

# 实验原理

  • 组织细胞可以用 IV 型胶原酶，I 型 DNA 酶进行消化，通过研磨后获得单细胞悬液。然而，这种组织单细胞悬液中的细胞种类繁杂，淋巴细胞只是其中一部分，为了研究 Th1 和 Th2 细胞的平衡，需要先把其中的淋巴细胞分离出来。Percoll 是经过聚乙烯比咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll 混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。根据细胞的比重不同，选择合适的 percoll 离心液的密度梯度，通过梯度离心可以有效的得到浸润的淋巴细胞。
  • 流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速定量和分选的技术。用 FITC 标记的 CD4 流式抗体染色细胞膜表面表达的 CD4 分子，刺激混液刺激 Th1 和 Th2 细胞因子的表达，并抑制高尔基体分泌细胞因子，用 Fix and Perm 对细胞进行破膜和固定，用 APC 标记的 IL-4 流式抗体及 PE 标记的 IFN-γ 流式抗体可以通过破膜孔与细胞内的相应细胞因子结合，从而通过 CD4^+^ IFN-γ^+^ 共同标记处 Th1 细胞， CD4^+^ IL-4^+^ 共同标记处 Th2 细胞。

# 实验目的

检测组织中 Th1/Th2 细胞的比例[1][2][3]。

# 实验材料

# 主要试剂

  • IV 型胶原酶
  • I 型 DNA 酶
  • Percoll 分离液
  • FITC 标记的 CD4 流式抗体
  • PE 标记的 IFN-γ 流式抗体
  • APC 标记的 IL-4 流式抗体
  • 4% 多聚甲醛
  • Fix and Perm 试剂盒
  • 刺激混液（Sigma）
  • RPMI 1640 培养基
  • 胎牛血清等

# 主要仪器

  • 超净工作台
  • 高压灭菌锅
  • 台式离心机
  • 流式细胞仪等

# 实验步骤

# 组织浸润淋巴细胞的分离

  1. 组织要在无菌环境下离体，然后用无菌剪刀将组织剪成 3mm3 大小的流体碎块，将剪碎的瘤块放入 50mL 离心管中。
  2. 向装有瘤体碎块的离心管中加入约 10mL RPMI 1640 培养基，IV 型胶原酶（0.5-1 mg/mL），I 型 DNA 酶（0.3-1 mg/mL），吹打混匀后，放入 37℃ 摇床上，185r/min，反应 1h 。
  3. 用 200 钼尼龙网将上述离心管中的悬液研磨后过滤到新的干净的离心管中，放入台式离心机中离心，2200 r/min，离心 7min ，弃去上清。
  4. 将沉淀用 5mL 50% percoll 离心液重悬，加入到 10mL 75% percoll 离心液的上层。室温下，将离心管放入台式离心机中，1260g/min，升 6 降 2，离心 20min 后吸取中层云雾层细胞，加入干净的离心管中，该细胞层即为淋巴细胞层。

# 流式细胞术检测组织浸润淋巴细胞的 Th1 和 Th2 细胞

  1. 将装有淋巴细胞的离心管放入台式离心机，1700 r/min，离心 7min ，弃去上清，向离心管中加入 500μL 含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基，用移液枪反复吹打，使管壁上的细胞充分混匀，另设空白对照孔。
  2. 将细胞悬液加入到 24 孔板中，各孔按照 1:500 的比例加入 1μL 刺激混液，吹打混匀，盖上孔板盖，放入 37℃，5% CO2 的细胞培养箱中，刺激 6h 。
  3. 吸取 24 孔板中的细胞悬液，加入到流式管中，1700 r/min 离心 7min ，弃去上清，向离心管中加入 100μL PBS 缓冲液，用移液枪反复吹打，使管壁上的细胞充分悬浮成单细胞悬液。
  4. 各管分别加入 FITC 标记的 CD4 流式抗体 1μL，反复吹打，使抗体与单细胞悬液充分混合，室温避光孵育 30min 。
  5. 各管放入离心机，1700 r/min 离心 7min ，弃去上清，用 250μL Fix and Perm 重悬细胞，充分混匀后，室温避光孵育 20min 。
  6. 各管放入离心机，2200 r/min 离心 7min ，弃去上清，分别加入 1 x buffer 250μL，反复吹打洗涤细胞，再次放入离心机中，2200 r/min 离心 7min ，弃去上清。
  7. 用 100μL 1 x buffer 重悬各管细胞，反复吹打充分混匀，分别加入 APC 标记的 IL-4 流式抗体 1μL，PE 标记的 IFN-γ 流式抗体 1μL，吹打混匀，空白对照管不加，避光孵育 60min 。
  8. 各管加入放入离心机，2200 r/min 离心 7min ，弃去上清，用 500 μL 1 x buffer 洗涤细胞，再次放入离心机中，2200 r/min 离心 7min ，弃去上清。
  9. 向各管加入 300μL 多聚甲醛，固定细胞，4℃避光保存，流式上机检测。

  1. Liu F, Dai W, Li C, et al. Role of IL-10-producing regulatory B cells in modulating T-helper cell immune responses during silica-induced lung inflammation and fibrosis. Sci Rep 2016; 6: 28911. ↩︎

  2. Qiu YY, Zhang YW, Qian XF, Bian T. miR-371, miR-138, miR-544, miR-145, and miR-214 could modulate Th1/Th2 balance in asthma through the combinatorial regulation of Runx3. Am J Transl Res 2017; 9(7): 3184-99. ↩︎

  3. Hetland G, Johnson E, Lyberg T, Kvalheim G. The Mushroom Agaricus blazei Murill Elicits Medicinal Effects on Tumor, Infection, Allergy, and Inflammation through Its Modulation of Innate Immunity and Amelioration of Th1/Th2 Imbalance and Inflammation. Adv Pharmacol Sci 2011; 2011: 157015. ↩︎

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