前言:检测外周血中 Treg/Th17 细胞的比例


# 实验原理

  • 流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他粒子,通过检测标记的荧光信号,实现高速定量和分选的技术。用 FITC 标记的 CD4 流式抗体和 Percp/cy5.5 标记的 CD25 流式抗体染色细胞膜表面表达的 CD4、CD25 分子,筛选出 CD+CD25 + 的活化的辅助性 / 诱导性 T 细胞,再筛选出 PE 标记的 Foxp3 阳性的 Treg 细胞。
  • Leukocyte activation cocltail 可以刺激 TH17 分泌细胞因子 IL-17 IL-17 可被破膜剂固定在细胞膜上,然后通过 CD4 阳性和 IL-17 阳性检测出 Th17 细胞。

# 实验目的

检测外周血中 Treg/Th17 的比例[1][2][3]

# 实验材料

# 主要试剂

  • 人外周血淋巴细胞分离液
  • FITC 标记的 CD4 流式抗体
  • Percp/cy5.5 标记的 CD25 流式抗体
  • PE 标记的 Foxp3 流式抗体
  • BB515 标记的 CD4 流式抗体
  • PE 标记 IL-17A 流式抗体,
  • Foxp3 Fix/perm buffer(Biolegend 公司)
  • Foxp3/perm buffer(Biolegend 公司),
  • Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeablization kit (Biolegend 公司)
  • Leukocyte activation cocktail(Biolegend 公司)
  • Stain buffer(Biolegend 公司)
  • RPMI-1640 培养基
  • PBS (pH=7.4)

# 主要仪器

  • 超净工作台
  • 流式细胞仪
  • 离心机
  • CO2 恒温培养箱

# 实验步骤

# 外周血单个核细胞(PBMC)的分离

  1. 收集样本抗凝外周血,加入 1:1 体积比的 PBS,混匀。
  2. 另取一干净离心管,上述血样等体积的 PBMC 分离液,将离心管倾斜成一定角度,将上述步骤中抗凝血与 PBS 的混合液沿管壁缓慢加入,不要震荡,此时血:PBS:PBMC 分离液的比例是 1:1:1,400g 离心 20min
  3. 离心后可见到液体分为 4 层,分别是血浆层、呈白色云雾状的 PBMC 层、淋巴细胞层、红细胞及粒细胞层。
  4. 吸取 PBMC 细胞层,移至干净的离心管中,加入 PBS,用移液枪反复轻柔吹打使 PBMC 悬浮起来,400g 离心 10min ,弃上清。
  5. 重复第 4 步,离心弃上清后,加入 200μL PBS,用移液枪反复轻柔吹打使 PBMC 悬浮起来成为单细胞悬液。

# Treg 的检测

  1. 往 PBMC 的单细胞悬液中加入荧光标记的 CD4,CD25 流式抗体,4℃避光孵育 30min
  2. 400g 离心 5min ,弃上清,加入 PBS,悬浮细胞后,400g 离心 5min ,弃上清,再重复 1 遍。
  3. 加入 250μL Foxp3/perm 液,充分混匀,4℃避光孵育 20min ,400g 离心弃上清。
  4. 加入荧光标记的 Foxp3 流式抗体,4℃避光孵育 30min
  5. 400g 离心 5min ,弃上清,加入 PBS,悬浮细胞后,400g 离心 5min ,弃上清,再重复 1 遍。
  6. 加入 200μL PBS 将细胞重悬为单细胞悬液后上流式细胞仪分析。

# Th17 的检测

  1. PBMC 刺激:往 24 孔板中加入 1mL PBMC,再分别加入 1 mL RPMI 1640 培养基,充分混匀。
  2. 每孔加入刺激剂 Leukocyte activation cocktail 3μL,用移液枪轻柔吹打混匀。
  3. 37℃,5% CO2 培养 5h
  4. 将细胞收集到离心管中,350g 离心 5min ,弃上清。
  5. 加入 2 mL stain buffer ,混匀后 350g 离心 5min ,弃上清。
  6. 加入 1 mL stain buffer ,重悬细胞,加入 BB515 标记的 CD4 流式抗体,混匀后 4℃避光孵育 15min ,350g 离心 5min ,弃上清。
  7. 加 入 2 mL stain buffer 重悬细胞为单细胞悬液 , 加入 250 μ L Fixation/Permeabilization solution ,4℃孵育 20min
  8. 用 1 mL 1 x BD Perm/Wash buffer 清洗细胞两次,350g 离心 5min ,弃上清。
  9. 用 100 μL 1 x BD Perm/Wash buffer 重悬破膜后的细胞,加入荧光标记的 IL-17A 流式抗体,4℃孵育 20min
  10. 用 2 mL 1 x BD Perm/Wash buffer 清洗细胞两次,350g 离心 5min ,弃上清。
  11. 用 200 μL 1 x BD Perm/Wash buffer 重悬固定染色后的细胞,上流式细胞仪分析。

  1. Jing F, Yang F, Cui F, Chen Z, Ling L, Huang X. Rapamycin alleviates inflammation and muscle weakness, while altering the Treg/Th17 balance in a rat model of myasthenia gravis. Biosci Rep 2017; 37(4). ↩︎

  2. Li J, Qiu SJ, She WM, et al. Significance of the balance between regulatory T (Treg) and T helper 17 (Th17) cells during hepatitis B virus related liver fibrosis. PLoS One 2012; 7(6): e39307. ↩︎

  3. Ding JW, Zhou T, Zheng XX, et al. The Effects of High Mobility Group Box-1 Protein on Peripheral Treg/Th17 Balance in Patients with Atherosclerosis. Acta Cardiol Sin 2018; 34(5): 399-408. ↩︎

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