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前言：检测外周血中 Treg/Th17 细胞的比例

# 实验原理

  • 流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速定量和分选的技术。用 FITC 标记的 CD4 流式抗体和 Percp/cy5.5 标记的 CD25 流式抗体染色细胞膜表面表达的 CD4、CD25 分子，筛选出 CD+CD25 + 的活化的辅助性 / 诱导性 T 细胞，再筛选出 PE 标记的 Foxp3 阳性的 Treg 细胞。
  • Leukocyte activation cocltail 可以刺激 TH17 分泌细胞因子 IL-17 ， IL-17 可被破膜剂固定在细胞膜上，然后通过 CD4 阳性和 IL-17 阳性检测出 Th17 细胞。

# 实验目的

检测外周血中 Treg/Th17 的比例[1][2][3]

# 实验材料

# 主要试剂

  • 人外周血淋巴细胞分离液
  • FITC 标记的 CD4 流式抗体
  • Percp/cy5.5 标记的 CD25 流式抗体
  • PE 标记的 Foxp3 流式抗体
  • BB515 标记的 CD4 流式抗体
  • PE 标记 IL-17A 流式抗体，
  • Foxp3 Fix/perm buffer（Biolegend 公司）
  • Foxp3/perm buffer（Biolegend 公司），
  • Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeablization kit （Biolegend 公司）
  • Leukocyte activation cocktail（Biolegend 公司）
  • Stain buffer（Biolegend 公司）
  • RPMI-1640 培养基
  • PBS （pH=7.4）

# 主要仪器

  • 超净工作台
  • 流式细胞仪
  • 离心机
  • CO2 恒温培养箱

# 实验步骤

# 外周血单个核细胞（PBMC）的分离

  1. 收集样本抗凝外周血，加入 1:1 体积比的 PBS，混匀。
  2. 另取一干净离心管，上述血样等体积的 PBMC 分离液，将离心管倾斜成一定角度，将上述步骤中抗凝血与 PBS 的混合液沿管壁缓慢加入，不要震荡，此时血：PBS：PBMC 分离液的比例是 1:1:1，400g 离心 20min 。
  3. 离心后可见到液体分为 4 层，分别是血浆层、呈白色云雾状的 PBMC 层、淋巴细胞层、红细胞及粒细胞层。
  4. 吸取 PBMC 细胞层，移至干净的离心管中，加入 PBS，用移液枪反复轻柔吹打使 PBMC 悬浮起来，400g 离心 10min ，弃上清。
  5. 重复第 4 步，离心弃上清后，加入 200μL PBS，用移液枪反复轻柔吹打使 PBMC 悬浮起来成为单细胞悬液。

# Treg 的检测

  1. 往 PBMC 的单细胞悬液中加入荧光标记的 CD4，CD25 流式抗体，4℃避光孵育 30min 。
  2. 400g 离心 5min ，弃上清，加入 PBS，悬浮细胞后，400g 离心 5min ，弃上清，再重复 1 遍。
  3. 加入 250μL Foxp3/perm 液，充分混匀，4℃避光孵育 20min ，400g 离心弃上清。
  4. 加入荧光标记的 Foxp3 流式抗体，4℃避光孵育 30min 。
  5. 400g 离心 5min ，弃上清，加入 PBS，悬浮细胞后，400g 离心 5min ，弃上清，再重复 1 遍。
  6. 加入 200μL PBS 将细胞重悬为单细胞悬液后上流式细胞仪分析。

# Th17 的检测

  1. PBMC 刺激：往 24 孔板中加入 1mL PBMC，再分别加入 1 mL RPMI 1640 培养基，充分混匀。
  2. 每孔加入刺激剂 Leukocyte activation cocktail 3μL，用移液枪轻柔吹打混匀。
  3. 37℃，5% CO2 培养 5h ；
  4. 将细胞收集到离心管中，350g 离心 5min ，弃上清。
  5. 加入 2 mL stain buffer ，混匀后 350g 离心 5min ，弃上清。
  6. 加入 1 mL stain buffer ，重悬细胞，加入 BB515 标记的 CD4 流式抗体，混匀后 4℃避光孵育 15min ，350g 离心 5min ，弃上清。
  7. 加 入 2 mL stain buffer 重悬细胞为单细胞悬液 ， 加入 250 μ L Fixation/Permeabilization solution ，4℃孵育 20min 。
  8. 用 1 mL 1 x BD Perm/Wash buffer 清洗细胞两次，350g 离心 5min ，弃上清。
  9. 用 100 μL 1 x BD Perm/Wash buffer 重悬破膜后的细胞，加入荧光标记的 IL-17A 流式抗体，4℃孵育 20min 。
  10. 用 2 mL 1 x BD Perm/Wash buffer 清洗细胞两次，350g 离心 5min ，弃上清。
  11. 用 200 μL 1 x BD Perm/Wash buffer 重悬固定染色后的细胞，上流式细胞仪分析。

  1. Jing F, Yang F, Cui F, Chen Z, Ling L, Huang X. Rapamycin alleviates inflammation and muscle weakness, while altering the Treg/Th17 balance in a rat model of myasthenia gravis. Biosci Rep 2017; 37(4). ↩︎

  2. Li J, Qiu SJ, She WM, et al. Significance of the balance between regulatory T (Treg) and T helper 17 (Th17) cells during hepatitis B virus related liver fibrosis. PLoS One 2012; 7(6): e39307. ↩︎

  3. Ding JW, Zhou T, Zheng XX, et al. The Effects of High Mobility Group Box-1 Protein on Peripheral Treg/Th17 Balance in Patients with Atherosclerosis. Acta Cardiol Sin 2018; 34(5): 399-408. ↩︎

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