前言:检测外周血中 Treg/Th17
细胞的比例
# 实验原理
- 流式细胞术是对悬液中的单细胞或其他粒子,通过检测标记的荧光信号,实现高速定量和分选的技术。用 FITC 标记的 CD4 流式抗体和 Percp/cy5.5 标记的 CD25 流式抗体染色细胞膜表面表达的 CD4、CD25 分子,筛选出 CD+CD25 + 的活化的辅助性 / 诱导性 T 细胞,再筛选出 PE 标记的 Foxp3 阳性的 Treg 细胞。
- Leukocyte activation cocltail 可以刺激 TH17 分泌细胞因子
IL-17
,IL-17
可被破膜剂固定在细胞膜上,然后通过 CD4 阳性和IL-17
阳性检测出 Th17 细胞。
# 实验目的
# 实验材料
# 主要试剂
- 人外周血淋巴细胞分离液
- FITC 标记的
CD4
流式抗体 - Percp/cy5.5 标记的
CD25
流式抗体 - PE 标记的
Foxp3
流式抗体 - BB515 标记的
CD4
流式抗体 - PE 标记
IL-17A
流式抗体, - Foxp3 Fix/perm buffer(Biolegend 公司)
- Foxp3/perm buffer(Biolegend 公司),
- Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeablization kit (Biolegend 公司)
- Leukocyte activation cocktail(Biolegend 公司)
- Stain buffer(Biolegend 公司)
- RPMI-1640 培养基
- PBS (pH=7.4)
# 主要仪器
- 超净工作台
- 流式细胞仪
- 离心机
- CO2 恒温培养箱
# 实验步骤
# 外周血单个核细胞(PBMC)的分离
- 收集样本抗凝外周血,加入 1:1 体积比的 PBS,混匀。
- 另取一干净离心管,上述血样等体积的 PBMC 分离液,将离心管倾斜成一定角度,将上述步骤中抗凝血与 PBS 的混合液沿管壁缓慢加入,不要震荡,此时血:PBS:PBMC 分离液的比例是 1:1:1,400g 离心
20min
。 - 离心后可见到液体分为 4 层,分别是血浆层、呈白色云雾状的 PBMC 层、淋巴细胞层、红细胞及粒细胞层。
- 吸取 PBMC 细胞层,移至干净的离心管中,加入 PBS,用移液枪反复轻柔吹打使 PBMC 悬浮起来,400g 离心
10min
,弃上清。 - 重复第 4 步,离心弃上清后,加入 200μL PBS,用移液枪反复轻柔吹打使 PBMC 悬浮起来成为单细胞悬液。
# Treg 的检测
- 往 PBMC 的单细胞悬液中加入荧光标记的 CD4,CD25 流式抗体,4℃避光孵育
30min
。 - 400g 离心
5min
,弃上清,加入 PBS,悬浮细胞后,400g 离心5min
,弃上清,再重复 1 遍。 - 加入 250μL Foxp3/perm 液,充分混匀,4℃避光孵育
20min
,400g 离心弃上清。 - 加入荧光标记的 Foxp3 流式抗体,4℃避光孵育
30min
。 - 400g 离心
5min
,弃上清,加入 PBS,悬浮细胞后,400g 离心5min
,弃上清,再重复 1 遍。 - 加入 200μL PBS 将细胞重悬为单细胞悬液后上流式细胞仪分析。
# Th17 的检测
- PBMC 刺激:往 24 孔板中加入 1mL PBMC,再分别加入 1 mL RPMI 1640 培养基,充分混匀。
- 每孔加入刺激剂
Leukocyte activation cocktail
3μL,用移液枪轻柔吹打混匀。 - 37℃,5% CO2 培养
5h
; - 将细胞收集到离心管中,350g 离心
5min
,弃上清。 - 加入 2 mL
stain buffer
,混匀后 350g 离心5min
,弃上清。 - 加入 1 mL
stain buffer
,重悬细胞,加入 BB515 标记的 CD4 流式抗体,混匀后 4℃避光孵育15min
,350g 离心5min
,弃上清。 - 加 入 2 mL
stain buffer
重悬细胞为单细胞悬液 , 加入 250 μ LFixation/Permeabilization solution
,4℃孵育20min
。 - 用 1 mL 1 x BD
Perm/Wash buffer
清洗细胞两次,350g 离心5min
,弃上清。 - 用 100 μL 1 x BD
Perm/Wash buffer
重悬破膜后的细胞,加入荧光标记的 IL-17A 流式抗体,4℃孵育20min
。 - 用 2 mL 1 x BD
Perm/Wash buffer
清洗细胞两次,350g 离心5min
,弃上清。 - 用 200 μL 1 x BD
Perm/Wash buffer
重悬固定染色后的细胞,上流式细胞仪分析。
Jing F, Yang F, Cui F, Chen Z, Ling L, Huang X. Rapamycin alleviates inflammation and muscle weakness, while altering the Treg/Th17 balance in a rat model of myasthenia gravis. Biosci Rep 2017; 37(4). ↩︎
Li J, Qiu SJ, She WM, et al. Significance of the balance between regulatory T (Treg) and T helper 17 (Th17) cells during hepatitis B virus related liver fibrosis. PLoS One 2012; 7(6): e39307. ↩︎
Ding JW, Zhou T, Zheng XX, et al. The Effects of High Mobility Group Box-1 Protein on Peripheral Treg/Th17 Balance in Patients with Atherosclerosis. Acta Cardiol Sin 2018; 34(5): 399-408. ↩︎