前言:寻找特异性激活基因。


  1. 实验原理
    为了系统的分析调节因子,我们计划:分别采用核糖体亲和沉淀测序(translating ribosome affinity purification-sequencing, TRAP-seq )和磷酸化核糖体亲和沉淀测序 ( pTRAP-seq ), 比较两者的差异,即可快速分析 XX 刺激前后的基因表达差异,获得被激活 或抑制的基因列表。通过 p-TRAP ,进一步验证其与 cFos 共定位率,一般超过 60% 认为是激活或抑制基因。我们计划采用类似的策略来寻找 YY 刺激所激活或者抑制基因。

  2. 实验目的
    寻找特异性激活基因。

  3. 实验材料

    1. 主要试剂
      • Cycloheximide Stock (1000x)
      • DHPC
      • HEPES
      • Kcl
      • MgCl2
      • DTT
      • Protease and Ptase Inhibitor Cocktail
      • RNAsin progmega
      • Cycloheximide
      • Superasi
      • RLT buffer(Qiagen)
    2. 主要仪器
      • BEADS
      • Falcon 管
      • 冰冻离心机
      • 移液器
  4. 实验步骤[1][2][3]

    1. Beads 准备, Protein L + Beads 孵育一小时,PBS 水清洗 30min ,抗体孵育一小时。
    2. 组织标本匀浆,建议使用玻璃制匀浆搅拌棒,离心(2000g 4 度 10min ),取上清,加入 NP40 和 DHPC 水,冰上静置 10min ,离心 20min ,去上清为 S20(Input),取其中 50uL,加入 RLT buffer (Qiagen),其余加入 Beads 中,作为 IP。
    3. 提取 RNA 步骤于常规 RNA 提取相似(注意 Qiagen 的 Kit 有特殊的洗液,RW1 和 RPF,参考 Qiagen 的 Protocol),建议使用 Qiagen 的 RNA 离心柱提取。

  1. Ouwenga R, Lake AM, O'Brien D, Mogha A, Dani A, Dougherty JD. Transcriptomic Analysis of Ribosome-Bound mRNA in Cortical Neurites In Vivo. JNeurosci2017; 37(36): 8688-705. ↩︎

  2. Thomson SR, Seo SS, Barnes SA, et al. Cell-Type-Specific Translation Profiling Reveals a Novel Strategy for Treating Fragile X Syndrome. Neuron2017; 95(3): 550-63 e5. ↩︎

  3. Vragovic K, Bartom E, Savaldi-Goldstein S. Quantitation of Cell Type-Specific Responses to Brassinosteroid by Deep Sequencing of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods Mol Biol 2017; 1564: 81-102. ↩︎

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