实验操作 | 核糖体亲和沉淀测序

前言：寻找特异性激活基因。

1. 实验原理
   为了系统的分析调节因子，我们计划：分别采用核糖体亲和沉淀测序（translating ribosome affinity purification-sequencing, TRAP-seq ）和磷酸化核糖体亲和沉淀测序 （ pTRAP-seq ）， 比较两者的差异，即可快速分析 XX 刺激前后的基因表达差异，获得被激活 或抑制的基因列表。通过 p-TRAP ，进一步验证其与 cFos 共定位率，一般超过 60% 认为是激活或抑制基因。我们计划采用类似的策略来寻找 YY 刺激所激活或者抑制基因。

2. 实验目的
   寻找特异性激活基因。

3. 实验材料

   1. 主要试剂
      • Cycloheximide Stock (1000x)
      • DHPC
      • HEPES
      • Kcl
      • MgCl2
      • DTT
      • Protease and Ptase Inhibitor Cocktail
      • RNAsin progmega
      • Cycloheximide
      • Superasi
      • RLT buffer（Qiagen）
   2. 主要仪器
      • BEADS
      • Falcon 管
      • 冰冻离心机
      • 移液器

4. 实验步骤^[1][2][3]

   1. Beads 准备， Protein L + Beads 孵育一小时，PBS 水清洗 30min ，抗体孵育一小时。
   2. 组织标本匀浆，建议使用玻璃制匀浆搅拌棒，离心（2000g 4 度 10min ），取上清，加入 NP40 和 DHPC 水，冰上静置 10min ，离心 20min ，去上清为 S20（Input），取其中 50uL，加入 RLT buffer （Qiagen），其余加入 Beads 中，作为 IP。
   3. 提取 RNA 步骤于常规 RNA 提取相似（注意 Qiagen 的 Kit 有特殊的洗液，RW1 和 RPF，参考 Qiagen 的 Protocol），建议使用 Qiagen 的 RNA 离心柱提取。