前言:寻找特异性激活基因。
实验原理
为了系统的分析调节因子,我们计划:分别采用核糖体亲和沉淀测序(translating ribosome affinity purification-sequencing,TRAP-seq
)和磷酸化核糖体亲和沉淀测序 (pTRAP-seq
), 比较两者的差异,即可快速分析 XX 刺激前后的基因表达差异,获得被激活 或抑制的基因列表。通过p-TRAP
,进一步验证其与 cFos 共定位率,一般超过 60% 认为是激活或抑制基因。我们计划采用类似的策略来寻找 YY 刺激所激活或者抑制基因。实验目的
寻找特异性激活基因。实验材料
- 主要试剂
- Cycloheximide Stock (1000x)
- DHPC
- HEPES
- Kcl
- MgCl2
- DTT
- Protease and Ptase Inhibitor Cocktail
- RNAsin progmega
- Cycloheximide
- Superasi
- RLT buffer(Qiagen)
- 主要仪器
- BEADS
- Falcon 管
- 冰冻离心机
- 移液器
- 主要试剂
- Beads 准备,
Protein L + Beads
孵育一小时,PBS 水清洗30min
,抗体孵育一小时。 - 组织标本匀浆,建议使用玻璃制匀浆搅拌棒,离心(2000g 4 度
10min
),取上清,加入 NP40 和 DHPC 水,冰上静置10min
,离心20min
,去上清为 S20(Input),取其中 50uL,加入 RLT buffer (Qiagen),其余加入 Beads 中,作为 IP。 - 提取 RNA 步骤于常规 RNA 提取相似(注意 Qiagen 的 Kit 有特殊的洗液,RW1 和 RPF,参考 Qiagen 的 Protocol),建议使用 Qiagen 的 RNA 离心柱提取。
- Beads 准备,
Ouwenga R, Lake AM, O'Brien D, Mogha A, Dani A, Dougherty JD. Transcriptomic Analysis of Ribosome-Bound mRNA in Cortical Neurites In Vivo. JNeurosci2017; 37(36): 8688-705. ↩︎
Thomson SR, Seo SS, Barnes SA, et al. Cell-Type-Specific Translation Profiling Reveals a Novel Strategy for Treating Fragile X Syndrome. Neuron2017; 95(3): 550-63 e5. ↩︎
Vragovic K, Bartom E, Savaldi-Goldstein S. Quantitation of Cell Type-Specific Responses to Brassinosteroid by Deep Sequencing of Polysome-Associated Polyadenylated RNA. Methods Mol Biol 2017; 1564: 81-102. ↩︎