前言:利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 RNA 分子杂交,通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号,来确定分布定位。
实验原理
利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 RNA 分子杂交,通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号,来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布,或者是结合了荧光探针的 RNA 分子在染色体或其他细胞器中的定位。
RNA FISH 不单可以定位 lncRNA,还增加了区分原始和成熟 lncRNA 转录物的能力,并由此得以将作用位点与合成位点分开,可在转录事件和成熟 lncRNA 的位置和耐久性之间添加时间空间信息,是 lncRNA 分析的有用工具。实验目的
确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布,或者是确定结合了荧光探针的 RNA 分子在染色体或其他细胞器中的定位。实验材料
- 主要试剂
通透液
(1X PBS
/ 0.5% Triton X-100):配置 50 ml通透液
,加入 5 ml 10X PBS 于 40 ml 水中,再加入 250 ul Triton X-100 并充分混匀预杂交液
(3% BSA in 4X SSC(柠檬酸钠缓冲液)): 配置 100 ml预杂交液
,加入 3g BSA 于 100 ml 4X SSC 中。实验当天新鲜配置杂交液
(10% 硫酸葡聚糖 in 4X SSC):配置 10 ml 杂交液:4 ml 水中加入 2ml 20X SSC、4 ml 25% 硫酸葡聚糖。注意充分混匀,实验当天新鲜配置- 50 ml DAPI 工作液:50 ml
1X PBS
中加入 200 mg BSA(乙酰胺),0.5 ul DAPI 储存液。现用现配,注意避光 - 洗液 I(4X SSC 0.1% Tween-20):配置 1L 洗液 I:799 ml 水中加入 200 ml 20X SSC, 1ml Tween-20
- 洗液 II(2X SSC):配置 1L 洗液 II:900 ml MilliQ - 水中加入 100 ml 20X SSC
- 洗液 III(1X SSC):配置 1L 洗液 III:950 ml MilliQ - 水中加入 50 ml 20X SSC
- 其它:浓盐酸、PBS 缓冲液、4% 多聚甲醛、无水乙醇、探针、探针混合液、防荧光 猝灭剂等
- 主要仪器
- 盖玻片
- 德国 Memmert 恒温烘箱
- YXQ-LS-30SII 立式压力蒸汽灭菌锅
- 湿盒
- 钻石笔
- 摇床
- Leica 激光共聚焦荧光显微镜
- 主要试剂
实验步骤[1]
- 样本准备
- 载波片处理 1% 盐酸酒精充分浸泡盖玻片,加盖,浸泡
1h
以上。流水冲洗盖玻片(控制流速, 勿冲出盖玻片);灭菌双蒸水洗 4-5 遍,室温,振荡洗涤;无水乙醇泡 3 次,每次 数分钟;倾去乙醇,放入温度为 60°C 左右烤箱烘干数小时,高压灭菌烤干 - 收获分化不同时期细胞。
- 载波片处理 1% 盐酸酒精充分浸泡盖玻片,加盖,浸泡
- 固定及透化
1X PBS
洗一次细胞- 室温,4% 多聚甲醛固定
10min
1X PBS
洗细胞,3 次,每次1min
- 每孔加入 1ml 预冷的
通透液
,置于 4 度冰箱,5min
- 弃去
通透液
1X PBS
洗细胞,3 次,每次加入 1ml
- 检测细胞或组织中的 RNA
- 用钻石笔在切片背面圈定用于原位杂交的范围
- 杂交前,先将切片置于约 200ul
预杂交液
中封闭,20-25 度,20min
- 同时,将杂交液预热于同上温度中
- 在探针混合液稀释好待用前,不要将
预杂交液
从切片上弃去 - 切片需置于湿盒中
- 杂交 1 小时,所用温度与预杂交温度相同,每张切片用 100-300ul 的杂交液,应 当小心吸取杂交液于切片上,确保杂交液充分覆盖切片
- 用洗液 I 洗片,3 次,每次
5min
,所用温度与之前相同,需避光 - 用洗液 II 洗片,1 次,
5min
,所用温度与之前相同,需避光 - 用洗液 III 洗片,1 次,
5min
,所用温度与之前相同,需避光 - 最后,用
1X PBS
洗片,1 次,5min
,室温,需避光
- 核染
- 加入 DAPI 溶液,避光孵育
5min
- 用
1X PBS
洗片,3 次,每次5min
,室温,需用摇床
- 加入 DAPI 溶液,避光孵育
- 封片
- 弃去 PBS,加入封片液,用盖玻片盖好,将切片竖立
2min
以使其干燥,需避光 - 加入防荧光猝灭剂,用指甲油封片,避免起泡
- 弃去 PBS,加入封片液,用盖玻片盖好,将切片竖立
- 采图
- 激光共聚焦荧光显微镜下观察,采图
- 样本准备
Sarma K, Levasseur P, Aristarkhov A, Lee JT. Locked nucleic acids (LNAs) reveal sequence requirements and kinetics of Xist RNA localization to the X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107(51): 22196-201. ↩︎