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前言：利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 RNA 分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定分布定位。

  1. 实验原理
    利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 RNA 分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的 RNA 分子在染色体或其他细胞器中的定位。
    RNA FISH 不单可以定位 lncRNA，还增加了区分原始和成熟 lncRNA 转录物的能力，并由此得以将作用位点与合成位点分开，可在转录事件和成熟 lncRNA 的位置和耐久性之间添加时间空间信息，是 lncRNA 分析的有用工具。

  2. 实验目的
    确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是确定结合了荧光探针的 RNA 分子在染色体或其他细胞器中的定位。

  3. 实验材料

    1. 主要试剂
      • 通透液 （ 1X PBS / 0.5% Triton X-100）：配置 50 ml 通透液 ，加入 5 ml 10X PBS 于 40 ml 水中，再加入 250 ul Triton X-100 并充分混匀
      • 预杂交液 （3% BSA in 4X SSC（柠檬酸钠缓冲液））： 配置 100 ml 预杂交液 ，加入 3g BSA 于 100 ml 4X SSC 中。实验当天新鲜配置
      • 杂交液 （10% 硫酸葡聚糖 in 4X SSC）：配置 10 ml 杂交液：4 ml 水中加入 2ml 20X SSC、4 ml 25% 硫酸葡聚糖。注意充分混匀，实验当天新鲜配置
      • 50 ml DAPI 工作液：50 ml 1X PBS 中加入 200 mg BSA（乙酰胺），0.5 ul DAPI 储存液。现用现配，注意避光
      • 洗液 I（4X SSC 0.1% Tween-20）：配置 1L 洗液 I：799 ml 水中加入 200 ml 20X SSC， 1ml Tween-20
      • 洗液 II（2X SSC）：配置 1L 洗液 II：900 ml MilliQ - 水中加入 100 ml 20X SSC
      • 洗液 III（1X SSC）：配置 1L 洗液 III：950 ml MilliQ - 水中加入 50 ml 20X SSC
      • 其它：浓盐酸、PBS 缓冲液、4% 多聚甲醛、无水乙醇、探针、探针混合液、防荧光 猝灭剂等
    2. 主要仪器
      • 盖玻片
      • 德国 Memmert 恒温烘箱
      • YXQ-LS-30SII 立式压力蒸汽灭菌锅
      • 湿盒
      • 钻石笔
      • 摇床
      • Leica 激光共聚焦荧光显微镜

  4. 实验步骤[1]

    1. 样本准备
      1. 载波片处理 1% 盐酸酒精充分浸泡盖玻片，加盖，浸泡 1h 以上。流水冲洗盖玻片（控制流速， 勿冲出盖玻片）；灭菌双蒸水洗 4-5 遍，室温，振荡洗涤；无水乙醇泡 3 次，每次 数分钟；倾去乙醇，放入温度为 60°C 左右烤箱烘干数小时，高压灭菌烤干
      2. 收获分化不同时期细胞。
    2. 固定及透化
      1. 1X PBS 洗一次细胞
      2. 室温，4% 多聚甲醛固定 10min
      3. 1X PBS 洗细胞，3 次，每次 1min
      4. 每孔加入 1ml 预冷的 通透液 ，置于 4 度冰箱， 5min
      5. 弃去 通透液
      6. 1X PBS 洗细胞，3 次，每次加入 1ml
    3. 检测细胞或组织中的 RNA
      1. 用钻石笔在切片背面圈定用于原位杂交的范围
      2. 杂交前，先将切片置于约 200ul 预杂交液 中封闭，20-25 度， 20min
      3. 同时，将杂交液预热于同上温度中
      4. 在探针混合液稀释好待用前，不要将 预杂交液 从切片上弃去
      5. 切片需置于湿盒中
      6. 杂交 1 小时，所用温度与预杂交温度相同，每张切片用 100-300ul 的杂交液，应 当小心吸取杂交液于切片上，确保杂交液充分覆盖切片
      7. 用洗液 I 洗片，3 次，每次 5min ，所用温度与之前相同，需避光
      8. 用洗液 II 洗片，1 次， 5min ，所用温度与之前相同，需避光
      9. 用洗液 III 洗片，1 次， 5min ，所用温度与之前相同，需避光
      10. 最后，用 1X PBS 洗片，1 次， 5min ，室温，需避光
    4. 核染
      1. 加入 DAPI 溶液，避光孵育 5min
      2. 用 1X PBS 洗片，3 次，每次 5min ，室温，需用摇床
    5. 封片
      1. 弃去 PBS，加入封片液，用盖玻片盖好，将切片竖立 2min 以使其干燥，需避光
      2. 加入防荧光猝灭剂，用指甲油封片，避免起泡
    6. 采图
      1. 激光共聚焦荧光显微镜下观察，采图

  1. Sarma K, Levasseur P, Aristarkhov A, Lee JT. Locked nucleic acids (LNAs) reveal sequence requirements and kinetics of Xist RNA localization to the X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107(51): 22196-201. ↩︎

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