实验操作 | GST pulldown

# 原理

# 基本原理

• GST Pull-Down 作为体外水平检测蛋白间直接互做的行之有效的方法，可用于证实预测的蛋白质 - 蛋白质相互作用的存在，也可用作未知的蛋白质 - 蛋白质相互作用的初始筛选测定法。是 CoIP 实验的辅助佐证。
• GST Pull-Down 实验基于 GST （glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽 - S - 转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合。将 GSH 固定于琼脂糖珠上，形成 GSH - 琼脂糖珠，将已知蛋白 a 与 GST 融合表达，获得的 GST-a 可与 GSH - 琼脂糖珠结合，若环境中存在与 a 蛋白互做的蛋白 b，则会形成 “琼脂糖珠 - GSH-GST-a-b” 复合物，与 a 蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

原理图。 GST Pull-Down 的主要原理是利用 DNA 重组技术将已知蛋白与 GST 融合，而融合蛋白通过 GST 与固化在载体上的 GTH（谷胱甘肽）亲和结合。简单来说，我们假定 a 蛋白和 b 蛋白可能存在互作，将纯化的融合 GST 的 a 蛋白和纯化的 b 蛋白以及能特异性结合 GST 的 Sephrose 4B beads 混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸 beads 进行 SDS-PAGE 电泳。通过 Western blot 检测结果，我们可以看到 GST-a 蛋白和 b 蛋白所对应的条带，即表明了 a 蛋白和 b 蛋白因发生相互作用而被 GST-a pull down（GST 对照只显示一个条带）。

# 与 CoIP 的区别

GST Pull-Down 就像把一男一女放在孤岛上，同类男女之间该发生的一般都会发生。这种关系是直接的， 西方的； CoIP 则是，众里寻他千百度， 那人却在灯火阑珊处。一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白，但是最终还是会有个最喜欢的， 而在 CoIP 中就能发现他的喜好。这种关系可能是直接的， 也可能是间接的，是更接近于东方的。
—— 摘自某不知名观点

• CoIP 的蛋白质处于天然状态，蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行，能够避免人为影响，还可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。但是问题是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；而且必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，如果抗体选错了就没有结果。
• GST Pull-Down 是将 GST 融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白结合。可以用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用，证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用。但问题是这个方法可能会出现假阳性。也就是也许是因为电荷作用的影响造成的吸附，而不是生理性的相互作用。因此一般作为 CoIP 的佐证手段。

# 操作

# GST-a 融合蛋白的制备

# 融合蛋白的表达

1. 将目的蛋白与 GST 的重组质粒转化到 BL21 菌株中；
2. 挑取单克隆到含有 5ml LB 培养基（加入 5ul 氨苄）的 10ml 试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；
3. 将培养菌液转移到含有 500ml LB（含 500ul 氨苄）的 1L 锥形瓶中，37℃，200rpm 培养数小时；
4. 测定 OD600 值，当 OD600 达到 0.6 左右时，加入适当浓度的 IPTG，在 20℃，200rpm 条件下培养 10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳 IPTG 浓度、诱导温度和时间）；
5. 诱导适当时间后，将菌液分次倒入 50ml 离心管中，4℃ 4000rpm 离心 10 分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于 - 80℃冰箱中；
6. 先加入少量 PBS 于离心管中，离心 5-10min 后弃去上清，再按每 10ml 菌液沉淀 1ml PBS 的量加入相应的 PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于 PBS 溶液中；
7. 把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎 20s，间隔 30s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清；
8. 将超声后的溶液 4℃ 4000rpm 离心 10 分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。

# GST-a 融合蛋白的纯化

1. 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积 50% Glutathione Sepharose 4B，4℃摇床上缓慢摇动 30~60min;
2. 4℃，4000rpm 离心 5min，弃去上清，该 Sepharose 上结合了 GST-a 融合蛋白；
3. 加入 200ul 预冷的 PBS 溶液，轻晃悬浮珠子，将 Sepharose 洗涤一次，4℃，4000rpm 离心 5min，弃去上清，重复此步骤 3 次；
4. 最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合 GST-a 的 Sepharose。

# b 蛋白的制备

b 蛋白可融合 His 标签进行原核表达，也可融合 Flag/HA/Myc 等标签进行真核表达。具体步骤根据标签的不同来选择。

一个手绘的流程图

# 体外蛋白的结合

1. 将结合有 GST-a 融合蛋白的 Sepharose 4B 悬浮在适量体积的缓冲液中，加入 20ul 含有 b 蛋白的溶液，同时采用结合有 GST 蛋白的 Sepharose 作为阴性对照，在摇床上晃动 4-8h（4℃）；
2. 4℃，4000rpm 离心 5min，弃去上清液；
3. 沿壁加入 200ul 预冷的缓冲液对 Sepharose 进行洗涤，
4. 4℃，4000rpm 离心 5min，弃上清，该步骤重复 3 次；
5. 吸干 Sepharose 上面的液体后，加入 20ul 1× 蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴 5min，放入 - 20℃冰箱备用；
6. 通过 SDS-PAGE 和 Western blot 进行检测。

体外蛋白结合流程

# 结果解读

文献图
在这篇文章中^[1]，可以看见 GST Pull-Down 实验结果图，与 CoIP 实验非常类似，主要也分为两部分：

• Input 部分检测未经过 GST Pull-Down 处理的样本，也是一种阳性对照。Input 部分有三张 WB 结果：
• GAPDH 代表以 GAPDH 抗体（anti-GAPDH）检测样本中 GAPDH 蛋白水平（GAPDH 和 Tubulin 一样，都是常用的内参蛋白），表明四个样本蛋白水平一致；
• GST-ARF6 代表以 GST-ARF6 抗体（文中采用的 anti-ARF6）检测样本中重组蛋白 GST-ARF6 水平；其中第 4 组 （每一列为一组）实验未添加重组蛋白 GST-ARF6；
• Exportin-5 代表以 Exportin-5 抗体（anti-Exportin-5）检测样本中 Exportin-5 蛋白水平，四组实验中均有 Exportin-5 蛋白。
• 随后再来看 GST pull-down 之后的实验数据，有两张 WB 结果图，我们可以看到体系中存在 GST-ARF6 蛋白时，通过 GST pull-down 就能将 Exportin-5 给 “拉” 下来，反之则不能；并且通过四组实验对比发现；GTP-γ-S 的存在能够促进 GST-ARF6 和 Exportin-5 的直接相互作用。

# 应用

与 CoIP 一致，鉴定蛋白之间的互作关系，还可以鉴定新的互作蛋白。

鉴定新的互作蛋白

# 相关视频

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• Pull-Down Assay 全流程讲解 -- 超级新手向