# 原理
# 基本原理
GST Pull-Down
作为体外水平检测蛋白间直接互做的行之有效的方法,可用于证实预测的蛋白质 - 蛋白质相互作用的存在,也可用作未知的蛋白质 - 蛋白质相互作用的初始筛选测定法。是 CoIP 实验的辅助佐证。GST Pull-Down
实验基于GST
(glutathione-S-transferase),即谷胱甘肽 - S - 转移酶蛋白,可以与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)结合。将 GSH 固定于琼脂糖珠上,形成 GSH - 琼脂糖珠,将已知蛋白 a 与 GST 融合表达,获得的 GST-a 可与 GSH - 琼脂糖珠结合,若环境中存在与 a 蛋白互做的蛋白 b,则会形成 “琼脂糖珠 - GSH-GST-a-b” 复合物,与 a 蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。
原理图。GST Pull-Down
的主要原理是利用 DNA 重组技术将已知蛋白与 GST 融合,而融合蛋白通过 GST 与固化在载体上的 GTH(谷胱甘肽)亲和结合。简单来说,我们假定 a 蛋白和 b 蛋白可能存在互作,将纯化的融合 GST 的 a 蛋白和纯化的 b 蛋白以及能特异性结合 GST 的 Sephrose 4B beads 混合在一起孵育一定时间,然后洗去未结合的蛋白,煮沸 beads 进行 SDS-PAGE 电泳。通过 Western blot 检测结果,我们可以看到 GST-a 蛋白和 b 蛋白所对应的条带,即表明了 a 蛋白和 b 蛋白因发生相互作用而被 GST-a pull down(GST 对照只显示一个条带)。
# 与 CoIP 的区别
GST Pull-Down
就像把一男一女放在孤岛上,同类男女之间该发生的一般都会发生。这种关系是直接的, 西方的;CoIP
则是,众里寻他千百度, 那人却在灯火阑珊处。一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白,但是最终还是会有个最喜欢的, 而在CoIP
中就能发现他的喜好。这种关系可能是直接的, 也可能是间接的,是更接近于东方的。
—— 摘自某不知名观点
CoIP
的蛋白质处于天然状态,蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行,能够避免人为影响,还可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。但是问题是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;而且必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,如果抗体选错了就没有结果。GST Pull-Down
是将 GST 融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上,与溶液中的目的蛋白结合。可以用来确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间的新的相互作用,证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用。但问题是这个方法可能会出现假阳性。也就是也许是因为电荷作用的影响造成的吸附,而不是生理性的相互作用。因此一般作为 CoIP 的佐证手段。
# 操作
# GST-a 融合蛋白的制备
# 融合蛋白的表达
- 将目的蛋白与 GST 的重组质粒转化到 BL21 菌株中;
- 挑取单克隆到含有 5ml LB 培养基(加入 5ul 氨苄)的 10ml 试管里,37℃恒温振荡培养箱中培养过夜;
- 将培养菌液转移到含有 500ml LB(含 500ul 氨苄)的 1L 锥形瓶中,37℃,200rpm 培养数小时;
- 测定 OD600 值,当 OD600 达到 0.6 左右时,加入适当浓度的 IPTG,在 20℃,200rpm 条件下培养 10-16h(通常需要进行预实验以确定最佳 IPTG 浓度、诱导温度和时间);
- 诱导适当时间后,将菌液分次倒入 50ml 离心管中,4℃ 4000rpm 离心 10 分钟,然后弃去上清,收集管底菌体,如暂时不用,可将菌体保存于 - 80℃冰箱中;
- 先加入少量 PBS 于离心管中,离心 5-10min 后弃去上清,再按每 10ml 菌液沉淀 1ml PBS 的量加入相应的 PBS,涡旋振荡,使菌体沉淀充分溶解于 PBS 溶液中;
- 把混合菌体置于冰水浴中,用超声仪进行破碎。每次超声破碎 20s,间隔 30s(破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定),经过适当时间超声后,溶液会显得澄清;
- 将超声后的溶液 4℃ 4000rpm 离心 10 分钟,上清液转移至新的离心管中,-80℃保存备用。
# GST-a 融合蛋白的纯化
- 在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积 50% Glutathione Sepharose 4B,4℃摇床上缓慢摇动 30~60min;
- 4℃,4000rpm 离心 5min,弃去上清,该 Sepharose 上结合了 GST-a 融合蛋白;
- 加入 200ul 预冷的 PBS 溶液,轻晃悬浮珠子,将 Sepharose 洗涤一次,4℃,4000rpm 离心 5min,弃去上清,重复此步骤 3 次;
- 最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体,但注意不要吸走珠子,即可获得结合 GST-a 的 Sepharose。
# b 蛋白的制备
b 蛋白可融合 His 标签进行原核表达,也可融合 Flag/HA/Myc 等标签进行真核表达。具体步骤根据标签的不同来选择。
一个手绘的流程图
# 体外蛋白的结合
- 将结合有 GST-a 融合蛋白的 Sepharose 4B 悬浮在适量体积的缓冲液中,加入 20ul 含有 b 蛋白的溶液,同时采用结合有 GST 蛋白的 Sepharose 作为阴性对照,在摇床上晃动 4-8h(4℃);
- 4℃,4000rpm 离心 5min,弃去上清液;
- 沿壁加入 200ul 预冷的缓冲液对 Sepharose 进行洗涤,
- 4℃,4000rpm 离心 5min,弃上清,该步骤重复 3 次;
- 吸干 Sepharose 上面的液体后,加入 20ul 1× 蛋白电泳上样缓冲液,沸水浴 5min,放入 - 20℃冰箱备用;
- 通过 SDS-PAGE 和 Western blot 进行检测。
体外蛋白结合流程
# 结果解读
文献图
在这篇文章中[1],可以看见GST Pull-Down
实验结果图,与CoIP
实验非常类似,主要也分为两部分:
Input
部分检测未经过GST Pull-Down
处理的样本,也是一种阳性对照。Input 部分有三张 WB 结果:GAPDH
代表以 GAPDH 抗体(anti-GAPDH)检测样本中 GAPDH 蛋白水平(GAPDH 和 Tubulin 一样,都是常用的内参蛋白),表明四个样本蛋白水平一致;GST-ARF6
代表以 GST-ARF6 抗体(文中采用的 anti-ARF6)检测样本中重组蛋白 GST-ARF6 水平;其中第 4 组 (每一列为一组)实验未添加重组蛋白 GST-ARF6;Exportin-5
代表以 Exportin-5 抗体(anti-Exportin-5)检测样本中 Exportin-5 蛋白水平,四组实验中均有 Exportin-5 蛋白。- 随后再来看 GST pull-down 之后的实验数据,有两张 WB 结果图,我们可以看到体系中存在 GST-ARF6 蛋白时,通过 GST pull-down 就能将 Exportin-5 给 “拉” 下来,反之则不能;并且通过四组实验对比发现;GTP-γ-S 的存在能够促进 GST-ARF6 和 Exportin-5 的直接相互作用。
# 应用
与 CoIP 一致,鉴定蛋白之间的互作关系,还可以鉴定新的互作蛋白。
鉴定新的互作蛋白
# 相关视频
- 什么是拉下实验?采用蛋白质体外结合实验,是如何分析确认预测蛋白质间相互作用的?
- Pull-Down Assay 全流程讲解 -- 超级新手向
An ARF6–Exportin-5 axis delivers pre-miRNA cargo to tumour microvesicles. Nat Cell Biol. ↩︎