# 原理
# 荧光酶素
- 荧光素酶报告基因 (
Luc
) 是指以荧光素 (luciferin
) 为底物来检测萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase
) 活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin
氧化oxyluciferin
,在 luciferin 氧化的过程中,会发出生物荧光 (bioluminescence
)。 - 荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶,哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和
Renilla
荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的应用中受到限制。 - 萤火虫荧光素酶灵敏度高,检测线性范围宽达 7~8 个数量级,是最常用于哺乳细胞的报道基因,用荧光比色计即可检测酶活性,因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用,无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla 荧光素酶催化肠腔(
coelenterazine
)氧化,产物可透过生物膜,可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中,可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。
荧光酶素原理示意图
# 报告基因
报告基因实验常用于研究目的基因的调控元件(启动子、增强子等),调控元件的 DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合,从而对基因的表达起抑制或增强的作用。整个报告基因的核心是将待定的调控元件与报告基因进行融合,检测报告基因的表达。由于报告基因的表达完全取决待定的调控元件,故报告基因的表达量与待定调控元件的活性直接相关。一个好的报告基因必须满足以下条件:
- 在所检测的细胞内不存在
- 检测起来非常方便
- 灵敏度要高,最好可以定量。相比于传统的 β- 半乳糖苷酶(
LacZ
,真核生物内有内源性干扰)、氯霉素乙酰转移酶(CAT
,检测复杂)、荧光蛋白(GFP
、YFP
、RFP
等,灵敏度不高,有些细胞有自发荧光现象),荧光素酶检测系统具有明显的优势。
报告基因原理示意图
# 双霉素实验
在荧光素酶报告系统中,只使用一种荧光素酶(一般为荧火虫荧光素酶),为单荧光素酶报告实验;由于不同的荧光素酶所发出的光具有不同的光谱性质,或使用不同的底物,一个报告实验中也可以使用两种或多种荧光素酶,其中最常用到的就是双荧光素酶(一般为荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶)报告实验,其中一种荧光素酶作为报告基因,另一种则作为内参,主要作用是减少外界因素对于实验数据产生的影响,这些影响主要包括操作误差、细胞接种差异、细胞处理的误差、孔间增殖差异等因素。因此,在调控元件(启动子、增强子)的研究中,双荧光素酶报告实验应用的会更多一些,整个的实验过程也非常的简便。
双霉素原理示意图
# 操作
# 一般步骤
具体操作需要依照商家提供的试剂盒,大体步骤如下:
- 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
- 设计引物用 PCR 法从基因组 DNA 中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(
pGL3-basic
)中。 - 筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
- 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。
- 培养 293(或其它目的细胞),并接种于 24 孔板中,生长 10-24 小时(80% 汇合度)。
- 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
- 提取蛋白并用于荧光素酶检测。
- 加入底物,测定荧光素酶的活性。
- 计算相对荧光强度,并与空载对照比较。
# 注意事项
- 荧光素酶检测试剂需在 15-25℃ 条件下预平衡后再进行反应,而后依据具体条件进行自动或手动检测。当用液闪计数仪时,加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。
- 如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测,样品可以在冰上保存大约 5h,在 -70℃ 可保存数月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。
- 利用上述方法检测冷的样品时,其信号强度将下降 5-15%。
- 在荧光素酶活性较高的情况下,导致信号超出线性范围(信号溢出)可用裂解液将样品进行稀释。
- 不要储存稀释过的样品。如果必须保存,要在稀释的样品中加入
BSA
至终浓度为 2.5mg/ml,这样可以保持样品的稳定性。 - 一些荧光仪在进行检测前需要 1-2s 的稳定,因此建议在开机后过一段时间再进行检测操作。
# 应用
用于检测转录因子与目的基因序列的结合。
例如本篇文献[1][2],作者想研究转录因子FOXM1
是否与Nedd4
的启动子相结合(c),因此使用了 luciferase,结果表明只有两个FOXM1
的识别序列都存在(而不是缺失或者突变)的时候,才有较强的荧光强度(e),证明能够结合。
Nedd4 ubiquitylates VDAC2/3 to suppress erastin-induced ferroptosis in melanoma. Nat Comm. ↩︎
本文的实验操作方法:Luciferase reporter assay. The human Nedd4 promoter was amplified by PCR from the genomic DNA of 293 T cells, and cloned into the pGL-4.23 vector. To generate the BS1/BS2 mutant construct, we deleted the binding sequences (ATAATTCCATA and ATTGTTACTGG) using the NEB Q5 site-directed mutagenesis kit. The mutant construct was verified by sequencing. Cells were cultured in six wells plates and transfected with the promoter construct along with the pRLCMV Renilla luciferase reporter plasmid as an internal control using polyfect transfection reagent (Qiagen 301107). Cells were lysed 48 h after transfection and assayed with the dual-luciferase reporter assay system (Promega E1910). To prepare cell lysis, remove growth media form cultured cells and wash cells in 1X PBS buffer. Add 500 μl 1× PLB buffer into each sample and gently shake for 20 min. Then, collect the PLB lysate and dispense samples into 96-well plate (20 μl per well). Add the luciferase assay substrate and measure the luciferase activity by using BeckmanCoulter DTX880. At least four replicates with three independent experiments were performed; transfection efficiency was normalized using Renilla luciferase. The PCR primers of Nedd4 promoter are Nedd4 promoter forward, 5′-TGGAGGTCTTCCT GTAATTATGGA-3′ and Nedd4 promoter reverse 5′-AGGAGGCGCTCCCTCAG CGACAGCA-3′. ↩︎