实验操作 | luciferin

# 原理

# 荧光酶素

• 荧光素酶报告基因 ( Luc ) 是指以荧光素 ( luciferin ) 为底物来检测萤火虫荧光素酶 ( fireflyluciferase ) 活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化 luciferin 氧化 oxyluciferin ，在 luciferin 氧化的过程中，会发出生物荧光 ( bioluminescence )。
• 荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和 Renilla 荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。
• 萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达 7～8 个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla 荧光素酶催化肠腔（ coelenterazine ）氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。

荧光酶素原理示意图

# 报告基因

报告基因实验常用于研究目的基因的调控元件（启动子、增强子等），调控元件的 DNA 结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。整个报告基因的核心是将待定的调控元件与报告基因进行融合，检测报告基因的表达。由于报告基因的表达完全取决待定的调控元件，故报告基因的表达量与待定调控元件的活性直接相关。一个好的报告基因必须满足以下条件：

1. 在所检测的细胞内不存在
2. 检测起来非常方便
3. 灵敏度要高，最好可以定量。相比于传统的 β- 半乳糖苷酶（ LacZ ，真核生物内有内源性干扰）、氯霉素乙酰转移酶（ CAT ，检测复杂）、荧光蛋白（ GFP 、 YFP 、 RFP 等，灵敏度不高，有些细胞有自发荧光现象），荧光素酶检测系统具有明显的优势。

报告基因原理示意图

# 双霉素实验

在荧光素酶报告系统中，只使用一种荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶），为单荧光素酶报告实验；由于不同的荧光素酶所发出的光具有不同的光谱性质，或使用不同的底物，一个报告实验中也可以使用两种或多种荧光素酶，其中最常用到的就是双荧光素酶（一般为荧火虫荧光素酶和海肾荧光素酶）报告实验，其中一种荧光素酶作为报告基因，另一种则作为内参，主要作用是减少外界因素对于实验数据产生的影响，这些影响主要包括操作误差、细胞接种差异、细胞处理的误差、孔间增殖差异等因素。因此，在调控元件（启动子、增强子）的研究中，双荧光素酶报告实验应用的会更多一些，整个的实验过程也非常的简便。

双霉素原理示意图

# 操作

# 一般步骤

具体操作需要依照商家提供的试剂盒，大体步骤如下：

1. 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
2. 设计引物用 PCR 法从基因组 DNA 中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（ pGL3-basic ）中。
3. 筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。
4. 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。
5. 培养 293（或其它目的细胞），并接种于 24 孔板中，生长 10-24 小时（80% 汇合度）。
6. 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。
7. 提取蛋白并用于荧光素酶检测。
8. 加入底物，测定荧光素酶的活性。
9. 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

# 注意事项

1. 荧光素酶检测试剂需在 15-25℃ 条件下预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手动检测。当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。
2. 如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约 5h，在 -70℃ 可保存数月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。
3. 利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降 5-15%。
4. 在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围（信号溢出）可用裂解液将样品进行稀释。
5. 不要储存稀释过的样品。如果必须保存，要在稀释的样品中加入 BSA 至终浓度为 2.5mg/ml，这样可以保持样品的稳定性。
6. 一些荧光仪在进行检测前需要 1-2s 的稳定，因此建议在开机后过一段时间再进行检测操作。

# 应用

用于检测转录因子与目的基因序列的结合。

例如本篇文献^[1][2]，作者想研究转录因子 FOXM1 是否与 Nedd4 的启动子相结合（c），因此使用了 luciferase，结果表明只有两个 FOXM1 的识别序列都存在（而不是缺失或者突变）的时候，才有较强的荧光强度（e），证明能够结合。