# 原理
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗体,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测组织或细胞内的相应抗原(或抗体)。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用荧光显微镜观察标本,荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光(黄绿色或橘红色),可以看见荧光所在的组织细胞,从而确定抗原或抗体的性质、定位,以及利用定量技术测定含量。
# 操作
- 制作爬片:对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,
PBS
洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用 PBS 离心洗涤(1000rpm, 5min
)2 次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 - 固定:根据需要选择适当的固定剂固定细胞。加 4%
多聚甲醛
固定 20min。 - 通透:使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。加 5%
Triton
15min。通透后用 PBS 洗涤 3×5 min。 - 封闭:使用封闭液(
山羊血清
)对细胞进行封闭,时间一般为 30min. - 一抗结合:室温孵育 1h 或者 4℃过夜。PBST 漂洗 3 次,每次冲洗 5min.
- 二抗结合:间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育 1h。
TBST
漂洗 3 次,每次冲洗 5min 后,再用蒸馏水漂洗一次。 - 封片及检测:滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
# 应用
免疫荧光主要用于目标蛋白的定位,也用于观察表达量:
一篇研究铁死亡的文章[1]。作者通过免疫荧光证明铁死亡的诱导因素会使PEBP1
的膜定位和表达量增加。
观察细胞定位的变化:
另一篇文章[2]。其中一部分研究PMAN
是否影响ELAVL1
的细胞定位(ELAVL1
平时定位在细胞核内,需要转移到细胞质中才可以发挥作用),通过免疫荧光,作者发现PMAN
的过表达促进了ELAVL1
的细胞质定位。
(DAPI 染的蓝色荧光即为细胞核,绿色荧光为ELAVL1
的免疫荧光结果,两个图像重合后观察绿色荧光的分布。)
PEBP1 Wardens Ferroptosis by Enabling Lipoxygenase Generation of Lipid Death Signals. Cell. 2017 Oct 19;171(3):628-641.e26. ↩︎
Hypoxia-induced HIF-1α/lncRNA-PMAN inhibits ferroptosis by promoting the cytoplasmic translocation of ELAVL1 in peritoneal dissemination from gastric cancer. Redox Biol. 2022 Jun;52:102312. ↩︎