实验操作 | 免疫荧光

# 原理

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

# 操作

1. 制作爬片：对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片， PBS 洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用 PBS 离心洗涤（ 1000rpm, 5min ）2 次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2. 固定：根据需要选择适当的固定剂固定细胞。加 4% 多聚甲醛 固定 20min。
3. 通透：使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。加 5% Triton 15min。通透后用 PBS 洗涤 3×5 min。
4. 封闭：使用封闭液（ 山羊血清 ）对细胞进行封闭，时间一般为 30min.
5. 一抗结合：室温孵育 1h 或者 4℃过夜。PBST 漂洗 3 次，每次冲洗 5min.
6. 二抗结合：间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育 1h。 TBST 漂洗 3 次，每次冲洗 5min 后，再用蒸馏水漂洗一次。
7. 封片及检测：滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

# 应用

免疫荧光主要用于目标蛋白的定位，也用于观察表达量：

一篇研究铁死亡的文章^[1]。作者通过免疫荧光证明铁死亡的诱导因素会使 PEBP1 的膜定位和表达量增加。

观察细胞定位的变化：

另一篇文章^[2]。其中一部分研究 PMAN 是否影响 ELAVL1 的细胞定位（ ELAVL1 平时定位在细胞核内，需要转移到细胞质中才可以发挥作用），通过免疫荧光，作者发现 PMAN 的过表达促进了 ELAVL1 的细胞质定位。
（DAPI 染的蓝色荧光即为细胞核，绿色荧光为 ELAVL1 的免疫荧光结果，两个图像重合后观察绿色荧光的分布。）