前言：甲基化芯片 —— 以人肝细胞癌细胞 DNA 甲基化谱的检测及分析为例[1][2]
# 实验原理
高通量甲基化芯片 Infinium Human Methylation 450K BeadChip 能够对人全基因组 45 万个甲基化位点进行检测，覆盖了上一代 27K 甲基化芯片 90% 的位点，并同时增加了 CpG 岛 以外的 CpG 位点、人类干细胞非 CpG 甲基化位点、正常组织与肿瘤（多种癌症）组织差异甲 基化位点、编码区以外的 CpG 岛、miRNA 启动子区域和已通过 GWAS 的疾病相关区域的位点。
# 实验目的
检测人肝细胞癌细胞的 DNA 甲基化谱，明确肝细胞癌细胞中差异甲基化位点和基因的表达分布情况，进一步探讨 DNA 异常甲基化与肝细胞癌发生发展的关系
# 实验材料
# 主要试剂
人永生化肝细胞 L02、人 HCC 细胞系 Huh7 均购自中国科学院细胞库；DNA 提取试剂盒 （QIAamp DNA Micro Kit）购自美国 QIAGEN 公司；甲基化修饰试剂盒购自沈阳百创特公司； 人全基因组甲基化芯片（ Infinium Human Methylation 450K Bead Chip ）购自美国 Illumina 公司。
# 主要仪器
核酸蛋白分析仪等。
# 实验步骤
# DNA 提取及甲基化修饰
用 0.25% 含 EDTA 胰酶消化细胞，收集细胞沉淀，取 20μL Proteinase K 加入到 1.5 mL Eppendorf 管内，按 DNA 提取试剂盒说明书中的操作步骤提取 Huh7、L02 细胞 DNA，Nano Drop 核酸蛋白分析仪检测 DNA 提取纯度和浓度，若 OD260 nm/OD280 mn 在 1.7-2.0 之间则符合实验要求， 则样品需要重新提取。将提取的 Huh7、L02 细胞 DNA 按照甲基化修饰试剂盒说明书中的操作 步骤进行甲基化修饰。
# 芯片杂交、扫描及数据分析
按照 Illumina 公司提供的步骤进行芯片杂交数据扫描使用 manifest 文件，采用 Illumina 公司官方提供的 Methylation Module of Genome Studio soft-ware using Methylation v1.9 软件对芯片数据进行分析。 β-value 代表 CpG 位点的甲基化水平，数值越大，越趋近于 1，甲基化程度越高。
β-difference （绝对值）为表达差异性分数。本研究使用 empirical ayes oderated 检验及 Bonferroni 校正来识别 Huh7 细胞和 L02 细胞之间的差异性甲基化 CpG 位点。初步筛 选差异性甲基化 CpG 位点的纳入标准为经过校正的 P 值（Adjust P）≤ 0.05，同时表达 差异性分数（|β-difference|）≥ 0.2，被定义为具有统计学意义。而 Adjust P > 0.05 和 CpG 覆盖 < 95% 则被排除。另外，为进一步筛选具有显著差异的甲基化 CpG 位点，本研究使 用了额外的过滤标准：
- Adjust P≤0.05，P≤1.06×10-7
- 显著的高甲基化位点，即 差异性甲基化水平 > 20%，L02 甲基化水平 < 25%
- 显著低甲基化位点，即差异性甲基化水 平 > 20%，Huh7 甲基化水平 < 25%
