实验操作 | 蛋白泛素化检测（IP-WB 法）

前言：利用 IP 法检测目标蛋白的泛素化修饰。

# 实验原理

泛素（ ubiquitin ， Ub ）是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的蛋白质。它和泛素激活酶（ E1 ）、泛素结合酶（ E2 ）、泛素连接酶（ E3 ）配合实现对特定蛋白的泛素化修饰，最终达到清除衰老、损伤以及错误折叠的蛋白质，对维持细胞正常的生理功能具有非常重要的作用。另外，某些泛素化修饰反应也能够实现与蛋白质降解无关的功能调控作用。
IP-WB 法通过免疫共沉淀方法将目标蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行 SDS 电泳和 western blot 分析。

# 实验目的

检测目标蛋白 P 的泛素化

# 实验材料

# 主要试剂

• 目标蛋白抗体（若是带有标签，也可用标签抗体）
• Protein A beads
• Protein B beads
• HA 标签抗体或泛素抗体
• 蛋白酶抑制剂等

# 主要仪器

• 离心机
• 恒温金属浴
• 酶标仪
• 电泳仪
• 凝胶成像系统
• Vortex 等

# 其他（请具体写明）

需要构建目标蛋白真核表达载体以及带 HA tag 的泛素载体

# 实验步骤^[1][2]

1. 将目标蛋白真核表达载体和带 HA tag 的泛素载体共转染细胞（可以所研究的目标细胞， 也可用 293T 等较好转染和表达的细胞株），步骤见质粒转染
2. 24h 后，加入 20μM 蛋白酶体抑制剂（MG-132），孵育 4h 后收取细胞
3. 加入预冷的细胞裂解液（使用前加入 PMSF 和磷酸酶抑制剂），与冰上裂解细胞 30min
4. 4℃，12000 转离心 20min ，提取上清蛋白至新的 1.5 ml EP 管中，加入 1μg 目标蛋白 抗体，4℃缓慢摇转过夜
5. 加入 20μl Protein A+G beads，继续 4℃缓慢摇转 4h
6. 4℃，2500 转离心 5min ，小心吸除上清，沉淀中加入 1ml PBS 洗涤，4℃，2500 转离心 5min ，洗涤步骤重复 3-5 遍
7. 沉淀中加入 20μl 1 x SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，Vortex 轻微震荡重悬沉淀
8. 4℃瞬时高速离心将样品离心至管底，与沸水中煮沸 10min 。此时样品可进一步作 WB 检测，或暂时不检测，可放于 - 20℃保存
9. 上清进而 SDS-PAGE 电泳，用 Western blotting 检测泛素化情况（用 HA 标签抗体）