前言:利用 IP 法检测目标蛋白的泛素化修饰。


# 实验原理

泛素( ubiquitinUb )是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的蛋白质。它和泛素激活酶( E1 )、泛素结合酶( E2 )、泛素连接酶( E3 )配合实现对特定蛋白的泛素化修饰,最终达到清除衰老、损伤以及错误折叠的蛋白质,对维持细胞正常的生理功能具有非常重要的作用。另外,某些泛素化修饰反应也能够实现与蛋白质降解无关的功能调控作用。
IP-WB 法通过免疫共沉淀方法将目标蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行 SDS 电泳和 western blot 分析。

# 实验目的

检测目标蛋白 P 的泛素化

# 实验材料

# 主要试剂

  • 目标蛋白抗体(若是带有标签,也可用标签抗体)
  • Protein A beads
  • Protein B beads
  • HA 标签抗体或泛素抗体
  • 蛋白酶抑制剂等

# 主要仪器

  • 离心机
  • 恒温金属浴
  • 酶标仪
  • 电泳仪
  • 凝胶成像系统
  • Vortex 等

# 其他(请具体写明)

需要构建目标蛋白真核表达载体以及带 HA tag 的泛素载体

# 实验步骤[1][2]

  1. 将目标蛋白真核表达载体和带 HA tag 的泛素载体共转染细胞(可以所研究的目标细胞, 也可用 293T 等较好转染和表达的细胞株),步骤见质粒转染
  2. 24h 后,加入 20μM 蛋白酶体抑制剂(MG-132),孵育 4h 后收取细胞
  3. 加入预冷的细胞裂解液(使用前加入 PMSF 和磷酸酶抑制剂),与冰上裂解细胞 30min
  4. 4℃,12000 转离心 20min ,提取上清蛋白至新的 1.5 ml EP 管中,加入 1μg 目标蛋白 抗体,4℃缓慢摇转过夜
  5. 加入 20μl Protein A+G beads,继续 4℃缓慢摇转 4h
  6. 4℃,2500 转离心 5min ,小心吸除上清,沉淀中加入 1ml PBS 洗涤,4℃,2500 转离心 5min ,洗涤步骤重复 3-5 遍
  7. 沉淀中加入 20μl 1 x SDS-PAGE 电泳上样缓冲液,Vortex 轻微震荡重悬沉淀
  8. 4℃瞬时高速离心将样品离心至管底,与沸水中煮沸 10min 。此时样品可进一步作 WB 检测,或暂时不检测,可放于 - 20℃保存
  9. 上清进而 SDS-PAGE 电泳,用 Western blotting 检测泛素化情况(用 HA 标签抗体)

  1. Singh R, Karri D, Shen H, et al. TRAF4-mediated ubiquitination of NGF receptor TrkA regulates prostate cancer metastasis. J Clin Invest 2018; 128(7): 3129-43. ↩︎

  2. Li Y, Li L, Chen M, et al. MAD2L2 inhibits colorectal cancer growth by promoting NCOA3 ubiquitination and degradation. Mol Oncol 2018; 12(3): 391-405. ↩︎

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