前言:利用 IP 法检测目标蛋白的泛素化修饰。
# 实验原理
泛素( ubiquitin
, Ub
)是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的蛋白质。它和泛素激活酶( E1
)、泛素结合酶( E2
)、泛素连接酶( E3
)配合实现对特定蛋白的泛素化修饰,最终达到清除衰老、损伤以及错误折叠的蛋白质,对维持细胞正常的生理功能具有非常重要的作用。另外,某些泛素化修饰反应也能够实现与蛋白质降解无关的功能调控作用。
IP-WB 法通过免疫共沉淀方法将目标蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行 SDS 电泳和 western blot 分析。
# 实验目的
检测目标蛋白 P 的泛素化
# 实验材料
# 主要试剂
- 目标蛋白抗体(若是带有标签,也可用标签抗体)
- Protein A beads
- Protein B beads
- HA 标签抗体或泛素抗体
- 蛋白酶抑制剂等
# 主要仪器
- 离心机
- 恒温金属浴
- 酶标仪
- 电泳仪
- 凝胶成像系统
- Vortex 等
# 其他(请具体写明)
需要构建目标蛋白真核表达载体以及带 HA tag
的泛素载体
# 实验步骤[1][2]
- 将目标蛋白真核表达载体和带
HA tag
的泛素载体共转染细胞(可以所研究的目标细胞, 也可用 293T 等较好转染和表达的细胞株),步骤见质粒转染 24h
后,加入 20μM 蛋白酶体抑制剂(MG-132),孵育4h
后收取细胞- 加入预冷的细胞裂解液(使用前加入 PMSF 和磷酸酶抑制剂),与冰上裂解细胞
30min
- 4℃,12000 转离心
20min
,提取上清蛋白至新的 1.5 ml EP 管中,加入 1μg 目标蛋白 抗体,4℃缓慢摇转过夜 - 加入 20μl Protein A+G beads,继续 4℃缓慢摇转
4h
- 4℃,2500 转离心
5min
,小心吸除上清,沉淀中加入 1ml PBS 洗涤,4℃,2500 转离心5min
,洗涤步骤重复 3-5 遍 - 沉淀中加入 20μl 1 x SDS-PAGE 电泳上样缓冲液,Vortex 轻微震荡重悬沉淀
- 4℃瞬时高速离心将样品离心至管底,与沸水中煮沸
10min
。此时样品可进一步作 WB 检测,或暂时不检测,可放于 - 20℃保存 - 上清进而 SDS-PAGE 电泳,用 Western blotting 检测泛素化情况(用 HA 标签抗体)
Singh R, Karri D, Shen H, et al. TRAF4-mediated ubiquitination of NGF receptor TrkA regulates prostate cancer metastasis. J Clin Invest 2018; 128(7): 3129-43. ↩︎
Li Y, Li L, Chen M, et al. MAD2L2 inhibits colorectal cancer growth by promoting NCOA3 ubiquitination and degradation. Mol Oncol 2018; 12(3): 391-405. ↩︎