前言:适用于少量甲基化目标检测的实验方法。
# 实验原理
DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶, 即在 DNA 甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使 CpG 二核苷酸 5’- 端的胞嘧啶转变为 5’- 甲基胞嘧啶。DNA 甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。重亚硫酸盐可使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,经 PCR 扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶,通过甲基化引物和非甲基化引物条带亮度,判断该位点甲基化程度。对 PCR 产物进行测序并且与未经处理的序列比较, 还可判断是否发生了甲基化。此方法精确度很高,能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐,适用于少量基因的检测,不建议大规模分析。
# 实验目的
在恶性肿瘤的发展中,甲基化的状态并不是一成不变,肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系,DNA 甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。
# 实验材料
# 主要试剂
- 细胞裂解液
- 蛋白酶 K
- 酚氯仿(
pH > 7.5
) - 氯仿
- 3M NaAc
- 无水乙醇
- 70% 乙醇
- ddH2O
# 主要仪器
水浴锅,EP 管等。
# 实验步骤[1][2]
# 基因组 DNA 抽提
- 收集 0.5-1*106 个细胞于 EP 管内,用 PBS 悬浮清洗,离心去上清
- 加入 500μL 细胞裂解液和 10μl 蛋白酶 K,重悬细胞,56° 水浴锅内孵育 1h,每隔
10min
翻转一次 - 加入 500μL 酚氯仿,翻转混匀
10min
,12000rpm 离心10min
- 剪掉枪头尖端,将上清转移至另一 EP 管中
- 加入等体积氯仿,翻转混匀
10min
后,12000rpm 离心10min
- 剪掉枪头尖端,小心将上清转移至另一 EP 管内
- 加入 1/10 体积 3M NaAc,混匀
- 加入 2 倍体积预冷无水乙醇,混匀,12000rpm 离心
10min
- 倒掉上清,加入 70% 乙醇洗涤沉淀,7500rpm 离心
5min
- 倒掉上清,加无水乙醇洗涤沉淀,7500rpm 离心
5min
- 倒掉上清,晾干乙醇后,加适量 ddH2O 溶解
- 测定浓度并电泳
# 重亚硫酸盐转化
# 提前准备
DNA wash buffer
:按照说明书,向 DNA wash buffer 瓶中加入规定量的乙醇,并标记。 18-25° 可放置 6 个月3N NaOH
:称取 3g NaOH,溶于 25mL ddH2O 脱盐溶液(desulfonation solution
):900μL 100% 乙醇 + 100μL3N NaOH
。每个反应使用 220μL- DNA 转化试剂的溶解 CAUTION 粉末状试剂有毒害,注意佩戴口罩手套
- 对于 10 个反应,称取 0.42g 转化试剂 1(
bisulfite conversion reagent 1
)和 0.134g 转化试剂 2(bisulfite conversion reagent 2
) - 向试剂 2 中加入 1mL 重亚硫酸盐溶剂(
bisulfite reagent diluent
),混匀至溶解 - 待试剂 2 溶解完全后,向其中加入试剂 1,分数次加入,每次加入量不宜过多,当难溶解时,70° 孵育有助于溶解
- 加入 120μL 浓盐酸,调节 pH 至 5.3-5.4
- 对于 10 个反应,称取 0.42g 转化试剂 1(
# 转化
- 预先准备好 37°、70° 水浴锅
- 向 1μg 待转化 DNA(10μL)中加入 1μL 3N NaOH,37° 孵育
10min
- 加入 120μL DNA 转化试剂,涡旋混匀
- 70° 孵育
40min
,封口膜密封;精确控制时间,勿长勿短
# 脱盐 / 去磷酸化 / 溶解
- 向转化后的 DNA 中加入 500μL
DNA binding buffer
,并完全混匀 - 将 DNA 纯化柱放入 2mL 收集管中,并加入样品
- 11000rpm 离心
1min
后倒掉废液 - 加入 700μL
DNA wash buffer
,11000rpm 离心1min
- 向膜中央加入 200μL 新鲜配制的脱盐溶液
- 室温放置 15min 后,11000rpm 离心
1min
,弃掉废液 - 加入 700μL
DNA wash buffer
,11000rpm 离心1min
,弃掉废液 - 重复步骤 7
- 将柱子放入另一 1.5mL 离心管中,11000rpm 离心
1min
,去除残余wash buffer
- 将柱子转移至干净的 1.5mL 离心管中,加入 25μL 预热
elution buffer
,12000rpm 离心1min
,再次加入 25μL 预热 elution buffer,12000rpm 离心 1min - -20° 保存 2 个月
# PCR 检测
# 灰度扫描法
灰度扫描可用于某位点甲基化的检测,通过甲基化引物和非甲基化引物条带亮度,判断该位点甲基化程度。采用两轮巢式 PCR 方法进行检测,引物分别根据转化前和转化后的序列进行设计,其 3’端的 3 个碱基中含有待检测的 CpG 位点,甲基化引物(MSP)为 CG,非甲基化引物(USP)为 TG,第二轮产物约为 150bp。取第一轮产物 2μL 作为第二轮 PCR 模板,扩增后将产物电泳,可根据灰度扫描分析判断甲基化程度。
# 测序法
与灰度扫描法相似,测序法通对第二轮巢式 PCR 产物测序,分析 CpG 岛内部 CG 甲基化 程度。其引物位置位于 CpG 岛边缘,产物包含尽可能多的 CpG。凝胶电泳分离回收 PCR 产物后,通过 TA 克隆对产物进行测序分析,为了保证结果具有统计学意义,测序克隆数应在 15 个以上。根据测序结果,分析统计甲基化位点比例。
# PCR 体系
试剂 / 药品 | 剂量 |
---|---|
HS EX-Taq (TAKARA) | 0.1μL |
10 x buffer | 2μL |
dNTPs | 2μL |
DNA 模板 | >2μL |
Primer 1 | 0.8μL |
Primer 2 | 0.8μL |
H2O | Up to 20μL |
Meng J, Wang L, Wang J, et al. METHIONINE ADENOSYLTRANSFERASE4 Mediates DNA and Histone Methylation. Plant Physiol 2018; 177(2): 652-70. ↩︎
Liu S, Liu F, Huang W, et al. MAGE-A11 is activated through TFCP2/ZEB1 binding sites de-methylation as well as histone modification and facilitates ESCC tumor growth. Oncotarget 2018; 9(3): 3365-78. ↩︎