实验操作 | DNA 甲基化检测（重亚硫酸盐法）

前言：适用于少量甲基化目标检测的实验方法。

# 实验原理

DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶， 即在 DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使 CpG 二核苷酸 5’- 端的胞嘧啶转变为 5’- 甲基胞嘧啶。DNA 甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。重亚硫酸盐可使 DNA 中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，经 PCR 扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，通过甲基化引物和非甲基化引物条带亮度，判断该位点甲基化程度。对 PCR 产物进行测序并且与未经处理的序列比较， 还可判断是否发生了甲基化。此方法精确度很高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，适用于少量基因的检测，不建议大规模分析。

# 实验目的

在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA 甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

# 实验材料

# 主要试剂

• 细胞裂解液
• 蛋白酶 K
• 酚氯仿（ pH > 7.5 ）
• 氯仿
• 3M NaAc
• 无水乙醇
• 70% 乙醇
• ddH2O

# 主要仪器

水浴锅，EP 管等。

# 实验步骤^[1][2]

# 基因组 DNA 抽提

1. 收集 0.5-1*10⁶ 个细胞于 EP 管内，用 PBS 悬浮清洗，离心去上清
2. 加入 500μL 细胞裂解液和 10μl 蛋白酶 K，重悬细胞，56° 水浴锅内孵育 1h，每隔 10min 翻转一次
3. 加入 500μL 酚氯仿，翻转混匀 10min ，12000rpm 离心 10min
4. 剪掉枪头尖端，将上清转移至另一 EP 管中
5. 加入等体积氯仿，翻转混匀 10min 后，12000rpm 离心 10min
6. 剪掉枪头尖端，小心将上清转移至另一 EP 管内
7. 加入 1/10 体积 3M NaAc，混匀
8. 加入 2 倍体积预冷无水乙醇，混匀，12000rpm 离心 10min
9. 倒掉上清，加入 70% 乙醇洗涤沉淀，7500rpm 离心 5min
10. 倒掉上清，加无水乙醇洗涤沉淀，7500rpm 离心 5min
11. 倒掉上清，晾干乙醇后，加适量 ddH2O 溶解
12. 测定浓度并电泳

# 重亚硫酸盐转化

# 提前准备

• DNA wash buffer ：按照说明书，向 DNA wash buffer 瓶中加入规定量的乙醇，并标记。 18-25° 可放置 6 个月
• 3N NaOH ：称取 3g NaOH，溶于 25mL ddH2O 脱盐溶液（ desulfonation solution ）：900μL 100% 乙醇 + 100μL 3N NaOH 。每个反应使用 220μL
• DNA 转化试剂的溶解 CAUTION 粉末状试剂有毒害，注意佩戴口罩手套
  • 对于 10 个反应，称取 0.42g 转化试剂 1（ bisulfite conversion reagent 1 ）和 0.134g 转化试剂 2（ bisulfite conversion reagent 2 ）
  • 向试剂 2 中加入 1mL 重亚硫酸盐溶剂（ bisulfite reagent diluent ），混匀至溶解
  • 待试剂 2 溶解完全后，向其中加入试剂 1，分数次加入，每次加入量不宜过多，当难溶解时，70° 孵育有助于溶解
  • 加入 120μL 浓盐酸，调节 pH 至 5.3-5.4

# 转化

• 预先准备好 37°、70° 水浴锅
• 向 1μg 待转化 DNA（10μL）中加入 1μL 3N NaOH，37° 孵育 10min
• 加入 120μL DNA 转化试剂，涡旋混匀
• 70° 孵育 40min ，封口膜密封；精确控制时间，勿长勿短

# 脱盐 / 去磷酸化 / 溶解

1. 向转化后的 DNA 中加入 500μL DNA binding buffer ，并完全混匀
2. 将 DNA 纯化柱放入 2mL 收集管中，并加入样品
3. 11000rpm 离心 1min 后倒掉废液
4. 加入 700μL DNA wash buffer ，11000rpm 离心 1min
5. 向膜中央加入 200μL 新鲜配制的脱盐溶液
6. 室温放置 15min 后，11000rpm 离心 1min ，弃掉废液
7. 加入 700μL DNA wash buffer ，11000rpm 离心 1min ，弃掉废液
8. 重复步骤 7
9. 将柱子放入另一 1.5mL 离心管中，11000rpm 离心 1min ，去除残余 wash buffer
10. 将柱子转移至干净的 1.5mL 离心管中，加入 25μL 预热 elution buffer ，12000rpm 离心 1min ，再次加入 25μL 预热 elution buffer，12000rpm 离心 1min
11. -20° 保存 2 个月

# PCR 检测

# 灰度扫描法

灰度扫描可用于某位点甲基化的检测，通过甲基化引物和非甲基化引物条带亮度，判断该位点甲基化程度。采用两轮巢式 PCR 方法进行检测，引物分别根据转化前和转化后的序列进行设计，其 3’端的 3 个碱基中含有待检测的 CpG 位点，甲基化引物（MSP）为 CG，非甲基化引物（USP）为 TG，第二轮产物约为 150bp。取第一轮产物 2μL 作为第二轮 PCR 模板，扩增后将产物电泳，可根据灰度扫描分析判断甲基化程度。

# 测序法

与灰度扫描法相似，测序法通对第二轮巢式 PCR 产物测序，分析 CpG 岛内部 CG 甲基化 程度。其引物位置位于 CpG 岛边缘，产物包含尽可能多的 CpG。凝胶电泳分离回收 PCR 产物后，通过 TA 克隆对产物进行测序分析，为了保证结果具有统计学意义，测序克隆数应在 15 个以上。根据测序结果，分析统计甲基化位点比例。

# PCR 体系