实验操作 | 外泌体的抽提

# 超速离心法

# 实验原理

• 离心操作时，将装有等量试液的离心容器对称放置在转子四周的吊杯内，依靠电动机带 动转子高速旋转所产生的离心力使试液分离。
• 尽管这种联合的方法可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点。例如同批次最多只能同时处理 6 个样本（转子限制）且回收率不稳定，前期需要准备大量材料且外泌体得率低。最重要的是重复离心很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且一些可溶性蛋白可与外泌体形成团块而产生污染。

# 实验目的

用于从生物体液（血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等）中提取外泌体。

# 实验材料

# 主要仪器

离心机

# 其他

外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫组合起来分离低丰度外泌体。需在离心机中以 100000~200000 g 离心沉淀（含有外泌体） 120 min ，使样品中的外泌体在 1.13~1.19 g/mL 的蔗糖密度范围内进行富集。

# 实验步骤

# 细胞培养和上清收集

冻存细胞复苏后培养在含 10 % 胎儿牛血清（ fetal bovine serum ， FBS ）的 RPMI-1640 培养基（培养基根据不同的细胞选择）中，置于 37℃、5 % CO2 培养箱中培养。待细胞生长至 80 % 以上密度时，吸去培养基，用磷酸缓冲盐溶液（ phosphate buffer saline ， PBS ） 洗涤细胞 2 遍，换成含 10 % 去除外泌体的 FBS 培养基（超速离心去除血清中的外泌体） 培养， 24 ~ 48 h 后收集培养液。4℃，3000×g，离心 30 min ；转移上清至新的离心管中，4℃，12000×g，离心 45 min ；转移上清至新的离心管中，置于 -80℃ 冰箱保存。

# 提取外泌体

将所收集上清液于 4℃，110000×g 离心 2h ，除去上清液，大体积（2~3mL）1×PBS 重悬沉淀。0.22μm 膜过滤，4℃，110000×g，离心 70min 。1mL 1×PBS 重悬沉淀，4℃，110000 ×g 离心 70min （++2 次 +{.wavy .success}），所获得沉淀重悬于 PBS 中，置 -80℃ 保存。

# 过滤离心法

# 实验原理

• 超滤离心法是利用不同截留相对分子质量的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。
• 这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

# 实验目的

用于从生物体液（血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等）中提取外泌体。

# 实验材料

# 主要仪器

超滤离心管、离心机

# 其他

外泌体是直径 30~100 nm 囊状小体，大于一般蛋白质。采用此方法需要考虑到与外泌体大小相似的其他囊泡的干扰。

# 实验步骤

# 细胞培养和上清收集

与超速离心法相似。

# 提取外泌体

• 超滤离心法：将收集的细胞培养上清置入中空纤维器中，去除细胞及细胞碎片，取滤液；加入 Mr100000 Ultra-15 超滤离心管中，以 1500×g 离心 15 min ，取浓缩液。将 30 g/L 的蔗糖 / 重水垫、浓缩液和 0.01 mol/L 的 PBS 以 3∶3∶4 的比例依次放入离心管中，4℃下用 Beckman 水平转子 SW40Ti 以 100000×g 超速离心 60 min 。取出承载外泌体的蔗糖 / 重水垫，0.01 mol/L 的 PBS 悬浮，加入 Mr100 000 Ultra 的高回收率、高流速切向流超滤离心 管中，以 1500×g 离心 15 min 。取浓缩液用 0.01 mol/L 的 PBS 悬浮沉淀即为外泌体。紫外分光光度仪初步定量。置于 - 80℃冰箱中保存备用。在上清特别多的情况下，可采用并联 方式将几个中空纤维器并联以提高效率。
• 分级分离法：收集细胞培养上清，采用分级分离法制备外泌体。即 4℃ 300×g 离心 10 min ;1200×g 离心 30 min ；10000×g 离心 30 min ；超速 100000×g 离心 60 min ，所获得的沉淀即为外泌体。用 PBS 将外泌体洗 1 遍，紫外分光光度仪初步定量。置于 - 80℃冰箱中保存备用。

# 试剂盒提取

# 实验目的

用于从生物体液（血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等）中提取外泌体。

# 实验材料

# 主要试剂

SBI 外泌体试剂盒，Thermo Fisher 的 Total Exosome Isolation 试剂盒等。

# 实验步骤

按照试剂盒说明书操作即可。

# 磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物（如 CD9 ， CD81 ， CD63 ， CD82 ， Hsp70 ，Ras 相关蛋白 Rab5b ，细胞骨架蛋白肌动蛋白和 TSG101 等），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。因为外泌体的异质性与它们的起源一致，不同外泌体上的标记物丰度也不同，通过特定的抗体组合可以从样本中捕获不同类型的外泌体，进行选择性分离。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受 pH 和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

# PEG-base 沉淀法^[3]

聚乙二醇（ PEG ）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。在 4℃ 利用 PEG 孵育后通过过滤或离心即可沉淀、回收外泌体。采用此种分离方法也存在不少问题：纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温 - 20 等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。
交流电动（ alternating current electrokinetic ， ACE ）微阵列芯片装置
简称 ACE 芯片 ，该芯片的单个电极的侧视图和俯视图如下所示，一个设备中有超过 1000 个电极，其表面涂覆薄薄一层多孔水凝胶，图中虚线所示 DEP 高场区即外泌体被富集的位置。在芯片电极处被富集的外泌体可直接用扫描电子显微镜（ SEM ）和免疫荧光等方法进行 分析与鉴定。该装置可以从未稀释的人血浆样品中快速分离获取外泌体，需要的样品量小， 在 15 分钟内将外泌体集中到微电极周围的高场区域。洗涤去除大量血浆物质后，使外泌体 浓缩在微电极上。分离、洗涤及芯片荧光分析步骤在 30 分钟内就可以完成。

# 基于新型声波流体技术（acoustofluidic technology）开发的声波筛选装置^[4]

细胞分选装置由一个微流体通道和两端的声换能器组成。两个声换能器生产的声波相互 接触所形成的驻波会生成一系列压力节点。当细胞或粒子流过通道并遇到一个节点时，压力会引导细胞稍微偏离中心，细胞位移的距离取决于细胞大小和可压缩性等其他性质。为了分离外泌体，研究人员将 2 个上述装置串联。第一个装置用来去除血液样本中的细胞和血小板，第二个装置的声波频率较高，可以把剩余血液样本中的更小的外泌体与稍大的胞外囊膜分离开来。利用这种装置完成 100ml 稀释血液样本的筛选工作用时不到 25 分钟。