# DNA 甲基化
过程:是在 DNA 甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到胞嘧啶上的过程,变成 5 - 甲基胞嘧啶(甲基加在 5 号碳原子上,真核生物只有这种甲基化修饰形式)。
# 功能:调控基因表达,尤其在胚胎发育中甲基化控制着时序性表达的基因(时序性表达即在特定时间阶段表达)。
# 一些概念
# Cpg 岛
CpG 岛( CpG island
)是个术语,是 DNA 发生甲基化的位置,指富含 CG 序列的区域。正常情况下,散在的 CpG 是被甲基修饰的,属于沉默状态。在编码基因的启动子或者其他转录调控区域中,CpG 容易成簇,形成 CpG island
。 CpG 岛跟散在的 CpG 不一样,它往往呈现非甲基化的状态。
- 长度 > 500bp
- GC 含量 > 55%
- CpG 比值 > 0.65
- 通常在启动子,甲基化与转录活性负相关
# 去甲基化酶及辅助因子
甲基化反应可逆,目前已知 DNA 甲基转移酶( DNA methyltransferase
):DNMT1、2、3a、3b。
- 维持甲基化(
maintenance methylation
)DNMT1
- 作用于仅有一条链甲基化的 DNA 双链使其完全甲基化
- 参与 DNA 复制双链中的新合成链的甲基化
- 从头甲基化(
de novo methylation
)DNMT3a
、DNMT3b
- 是对 DNA 链甲基化状态的重构
- 不依赖于 DNA 复制, 是在完全非甲基化的位点上引入甲基
# 对 DNMT2
的认识较少。
# DNA 甲基化结合蛋白
这类蛋白通过一种保守的结构域,称为甲基化 DNA 结合结构域( methylated DNA-binding domain
, MBD
),结合甲基化的 CpG。 MBD
识别甲基化位点,负责招募阻遏蛋白,抑制转录过程。
MBD
家族
MeCP2
:介导甲基化与组蛋白乙酰化之间的联系MBD1-4
# DNA 去甲基化过程
- 脱氨酶参与的碱基切除修复途径(
base excision repair
,BER
) - 直接移除甲基化 CpG 的核苷酸切除修复机制(
nucleotide excision repair
,NER
)
# 甲基化检测方法
- 酶切法
- 直接跑胶
- 酶切 + PCR
- 酶切 + Southern Blotting(最可靠)
- PCR 衍生技术
- 针对已知位点
- MS-PCR,MSP
原理是 DNA 经过亚硫酸氢钠处理后,非甲基化的胞嘧啶会转变成尿嘧啶而甲基化的保持不变,这样设计两对特异性的引物去扩增甲基化和非甲基化的 DNA 结果就出来了。 - BSP
同样用亚硫酸氢盐处理 DNA,设计引物进行 PCR,在扩增过程中尿嘧啶会被识别为胸腺嘧啶,DNA 序列就改变了,对 PCR 产物进行测序就可以获得结果。 - HRM,高分辨溶解曲线技术
- 用带荧光标记的 Taqman 探针做 qPCR
- MS-PCR,MSP
- 大规模筛选
- 甲基化组学(
Methylome
)
- 甲基化组学(
- 针对目标机制及其上游
- 通过软件找目标基因启动子区的 CpG 岛([[18 策]]) → 针对已知位点检测
- 针对已知位点
# 组蛋白甲基化
- 过程
组蛋白 N 段通过组蛋白甲基化转移酶 (Histone methylation transferase
,HMT
)催化,可以发生在赖氨酸和精氨酸两种氨基酸上。 - 功能:或抑制或促进转录
- 检测:位点检测通过 Western
# 研究策略
- 找启动子,分析 CpG
- 实验检测甲基化状态变化
- 找甲基化转移酶、甲基化结合蛋白和去甲基化途径上的明星分子。
- 还可以进行组蛋白甲基化位点检测(western)
如果主变量是 TF,则先找靶基因。