首页 科研 实验设计思路

# 蛋白的研究路径

  • TF → 已知 DNA 结合 motif → 荧光素报告基因、ChIP
  • 非 TF → 找蛋白 - 蛋白互作
  • 其他的蛋白结合对象

# 蛋白 - 蛋白实验手段

# 质谱

查蛋白身份证

# co-IP

  • 材料
    • ProteinA、G → 磁珠、琼脂糖珠（ beads ）
    • WB 相关材料
    • 目标蛋白抗体
    • ……
  • 目的
    • 纯化蛋白
    • 研究互作
    • 研究修饰
  • 可靠性
    • 正反拉
    • 阴性对照
      • 只加珠子不加抗体
      • IgG 替换抗体
    • 阳性对照
      • IP 抗 A 拉 A， WB 抗 A 检 A
  • 看图
    • Input - 沉淀完的蛋白样品
    • IP - 沉淀靶蛋白的抗体
    • IB - 检测目标蛋白的抗体
  • Tag
    • 提供人为加上去的抗原表位
    • 识别外源基因的表达
    • 克服无可用抗体
    • 分类
      • His、Flag、HA、Myc - 单标签
      • GFP、GRP - 标签 & reporter

# pulldown

一般采用 GST 标签。

  • 步骤
    1. 构建 GST 和目的基因的融合蛋白
    2. GST 融合蛋白与谷胱甘肽的特异性结合，制备到固相载体也就是层析柱上（ bait 步骤）
    3. 细胞裂解液过柱
    4. 溶剂洗脱
  • 目的
    • 互作蛋白鉴定
    • 已知互作验证
  • 看图
    • 细胞裂解液作 input
    • 无融合基因做阴性对照
    • GST 融合蛋白作为 bait ，以相互作用蛋白的特异性 抗体作为 blot 检测的抗体

# 酵母双杂交（Y2H）

# 噬菌体展示

# 表面等离子共振（SPR）

# 荧光共振能量转移（FRET）

# 蛋白芯片

# 策略

金标准 ：外源性 coIP（省钱） → 内源性 coIP → pulldown

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