# 蛋白的研究路径
- TF → 已知 DNA 结合 motif → 荧光素报告基因、ChIP
- 非 TF → 找蛋白 - 蛋白互作
- 其他的蛋白结合对象
# 蛋白 - 蛋白实验手段
# 质谱
查蛋白身份证
# co-IP
- 材料
- ProteinA、G → 磁珠、琼脂糖珠(
beads
) - WB 相关材料
- 目标蛋白抗体
- ……
- ProteinA、G → 磁珠、琼脂糖珠(
- 目的
- 纯化蛋白
- 研究互作
- 研究修饰
- 可靠性
- 正反拉
- 阴性对照
- 只加珠子不加抗体
- IgG 替换抗体
- 阳性对照
IP
抗 A 拉 A,WB
抗 A 检 A
- 看图
Input
- 沉淀完的蛋白样品IP
- 沉淀靶蛋白的抗体IB
- 检测目标蛋白的抗体
- Tag
- 提供人为加上去的抗原表位
- 识别外源基因的表达
- 克服无可用抗体
- 分类
- His、Flag、HA、Myc - 单标签
- GFP、GRP - 标签 & reporter
# pulldown
一般采用 GST 标签。
- 步骤
- 构建 GST 和目的基因的融合蛋白
- GST 融合蛋白与谷胱甘肽的特异性结合,制备到固相载体也就是层析柱上(
bait
步骤) - 细胞裂解液过柱
- 溶剂洗脱
- 目的
- 互作蛋白鉴定
- 已知互作验证
- 看图
- 细胞裂解液作
input
- 无融合基因做阴性对照
- GST 融合蛋白作为
bait
,以相互作用蛋白的特异性 抗体作为 blot 检测的抗体
- 细胞裂解液作
# 酵母双杂交(Y2H)
# 噬菌体展示
# 表面等离子共振(SPR)
# 荧光共振能量转移(FRET)
# 蛋白芯片
# 策略
金标准 :外源性 coIP(省钱) → 内源性 coIP → pulldown