首页 科研 实验设计思路

# ceRNA

ceRNA 的基本框架：把两套 RNA-RNA 交互作用叠加在一起就成了 ceRNA，其中有一个 miRNA 是共用的。三个变量，一个 miRNA 两个靶基因。本质上是 miRNA 作用机制的升级。

两个内源 RNA 之间的互相竞争性结合 miRNA ，从而对彼此的表达产生影响。

一个 miRNA 结合的靶基因可能有上百个，而 mRNA 的 3’UTR 和大量的 非编码 RNA 上，也有远远不止一个的 miRNA 识别元件（ MRE ， miRNA recognition elements ）。

# 新型研究方法

针对 RISC 复合体 → 拉 AGO2 → 测序被拉下的 RNA

# 研究思路

  • 从零开始，直接从非编码 RNA 开始筛选
    • 在确定的疾病和表型组合下利用特有的样本，细胞模型或者动物模型直接 进行非编码 RNA 的筛选，比如筛 circRNA ，新的 circRNA+ceRNA 机制
  • 前期工作有功能基因
    • 从基因反推 ceRNA
    • 充当 ceRNA 的有 mRNA 、假基因 （ pseudogene ）、 lncRNA 和 circRNA
    • 猜一批 ceRNA 编码的功能蛋白来验证
  • 前期工作有 miRNA
    • 围绕这个 miRNA 延伸 ceRNA 机制
    • 做 miRNA 过表达之后的 RNA 表达谱 → 筛选一下，从差异表达趋势一致的分子中做 ceRNA 预测 → 进行验证

# 实验设计

  • 主变量
    • mRNA ， lncRNA ， circRNA ， pseudogene
    • 原则：原创新颖
    • 主变量介导的表型 → 原创性发现
    • 围绕主变量的功能套一正一反，体外体内细胞动物，组织标本表达检测以及相关性分析
  • 第二变量
    • 一定是 miRNA
    • miRNA 跟表型的报道不需要已知
  • 第三变量
    • 一定是编码蛋白的功能基因
    • miRNA 调节编码基因可以是已知的

# 五个必要环节

  • 第一步
    • 假定是 ceRNA → 表达应该具有正相关的关系 → qPCR、Western，组织样本、细胞株。
    • 如果主变量是非编码 RNA → 证明存在疾病特异性表达
  • 第二步
    • 主变量的上下调检测编码基因的表达，以及编码基因的上下调检测主变量表达
    • 做主变量 RNAi → 抑制疾病发生？
    • 做功能基因 RANi → 主变量变化？
  • 第三步
    • 验证 miRNA 可以抑制主变量和编码基因
    • miRNA 与主变量和编码基因 3’UTR 之间结合的靶序列信息 → 数据库预测
    • 过表达 miRNA → 主变量和编码基因表达的影响？ → qPCR 和 WB
  • 第四步
    • 荧光素酶报告基因实验 → 证明主变量和编码基因确实是 miRNA 的靶基因
    • 2 组 miRNA 和靶基因的关系都要做到位
  • 第五步
    • Rescue 实验
    • 主变量和 miRNA 的逆向操作 → 看编码基因的回复以及表型回复
    • 用 Dicer 敲除的细胞来验证主变量和编码基因之间的调节关系是依赖于 miRNA
    • 若编码基因显著影响表型 → 跳过 miRNA rescue → 做编码基因的 rescue
  • 加分步骤
    • 过表达主变量后做 AGO2 抗体 的 RNA 免疫沉淀 → 看拉下来的复合物里面主变量 RNA 结合多了之后，是不是编码基因的 mRNA 结合少了
更新于