# ceRNA
ceRNA 的基本框架:把两套 RNA-RNA 交互作用叠加在一起就成了 ceRNA,其中有一个 miRNA
是共用的。三个变量,一个 miRNA 两个靶基因。本质上是 miRNA 作用机制的升级。
两个内源 RNA 之间的互相竞争性结合 miRNA
,从而对彼此的表达产生影响。
一个 miRNA
结合的靶基因可能有上百个,而 mRNA 的 3’UTR 和大量的 非编码 RNA 上,也有远远不止一个的 miRNA
识别元件( MRE
, miRNA recognition elements
)。
# 新型研究方法
针对 RISC 复合体 → 拉 AGO2 → 测序被拉下的 RNA
# 研究思路
- 从零开始,直接从非编码 RNA 开始筛选
- 在确定的疾病和表型组合下利用特有的样本,细胞模型或者动物模型直接 进行非编码 RNA 的筛选,比如筛
circRNA
,新的circRNA+ceRNA
机制
- 在确定的疾病和表型组合下利用特有的样本,细胞模型或者动物模型直接 进行非编码 RNA 的筛选,比如筛
- 前期工作有功能基因
- 从基因反推 ceRNA
- 充当 ceRNA 的有
mRNA
、假基因 (pseudogene
)、lncRNA
和circRNA
- 猜一批 ceRNA 编码的功能蛋白来验证
- 前期工作有
miRNA
- 围绕这个
miRNA
延伸 ceRNA 机制 - 做
miRNA
过表达之后的 RNA 表达谱 → 筛选一下,从差异表达趋势一致的分子中做 ceRNA 预测 → 进行验证
- 围绕这个
# 实验设计
- 主变量
mRNA
,lncRNA
,circRNA
,pseudogene
- 原则:原创新颖
- 主变量介导的表型 → 原创性发现
- 围绕主变量的功能套一正一反,体外体内细胞动物,组织标本表达检测以及相关性分析
- 第二变量
- 一定是 miRNA
miRNA
跟表型的报道不需要已知
- 第三变量
- 一定是编码蛋白的功能基因
miRNA
调节编码基因可以是已知的
# 五个必要环节
- 第一步
- 假定是 ceRNA → 表达应该具有正相关的关系 → qPCR、Western,组织样本、细胞株。
- 如果主变量是非编码 RNA → 证明存在疾病特异性表达
- 第二步
- 主变量的上下调检测编码基因的表达,以及编码基因的上下调检测主变量表达
- 做主变量 RNAi → 抑制疾病发生?
- 做功能基因 RANi → 主变量变化?
- 第三步
- 验证
miRNA
可以抑制主变量和编码基因 miRNA
与主变量和编码基因 3’UTR 之间结合的靶序列信息 → 数据库预测- 过表达
miRNA
→ 主变量和编码基因表达的影响? → qPCR 和 WB
- 验证
- 第四步
- 荧光素酶报告基因实验 → 证明主变量和编码基因确实是
miRNA
的靶基因 - 2 组
miRNA
和靶基因的关系都要做到位
- 荧光素酶报告基因实验 → 证明主变量和编码基因确实是
- 第五步
- Rescue 实验
- 主变量和
miRNA
的逆向操作 → 看编码基因的回复以及表型回复 - 用 Dicer 敲除的细胞来验证主变量和编码基因之间的调节关系是依赖于
miRNA
- 若编码基因显著影响表型 → 跳过
miRNA
rescue → 做编码基因的 rescue
- 加分步骤
- 过表达主变量后做 AGO2 抗体 的 RNA 免疫沉淀 → 看拉下来的复合物里面主变量 RNA 结合多了之后,是不是编码基因的 mRNA 结合少了