16 字口诀:细胞交互、 横纵兼容、分泌吸收、跨越回复


# 数据扩充

单从受体细胞的效应途径看, miRNA 介导靶基因调节的研究设计和数据套路荧光素酶报告基因实验,以及反正正、反反反的 Rescue 是一致的,也符合结合位点验证规则。但是因为涉及到了 2 种细胞的交互作用,可想而知数据内容上会有不小的扩充:

  1. 供体细胞里 miRNA 的表达情况
  2. miRNA 分泌情况
  3. 包裹在囊泡中的 miRNA 是否被受体细胞吸收

# 套路概述

  • 上半部
    • 供体细胞在疾病中介导主变量 miRNA 的表达改变
    • 检测细胞培养上清中分泌的囊泡数量以及内含的 miRNA 数量变化
  • 下半部
    • 检测受体细胞接受了囊泡中的 miRNA
    • 明确 miRNA 来自外源导入
    • 明确 miRNA非受体细胞合成
    • 解释清楚主变量 miRNA 的功能和靶基因机制

# 十步法

# 第一步

  • 供体细胞的培养上清处理受体细胞 → 观察表型变化
  • 相当于加药 → 用相应的法和标进行评价
  • 其实是预实验

# 第二、三步

即寻找目标 candidates、验证其介导细胞交互功能。

  • 表达差异
    • 检测细胞上清的微泡或者外泌体里面分子的表达 → 找差异 candidates
    • 制备上清样品 → miRNA 芯片、测序 → 功能验证
    • 供受体细胞远 → 采用血清外泌体样本检测
  • 正反回复
    • 阻断分子形成
      • 在供体细胞过表达 / 沉默 miRNA → 上清刺激受体细胞 → 表型改变?
      • 一般做 loss of function 即可
    • 阻断外泌体合成
      • 阻断囊泡合成 → 表型改变?
      • 中性神经鞘磷脂酶的抑制剂
      • 沉默关键基因: Rab27a

# 第四步

外泌体特色数据验证套路。

  • 分离
    • 有专业试剂盒
    • 离心
    • 色谱
    • 过滤
    • 基于高分子聚合物的沉淀和免疫亲和分离
  • 定量
    • 鉴定的数据有透射电镜TEM )观察外泌体的形态照片
    • 动态光散射DLS )或者其他的方法分析颗粒粒径大小、颗粒密度
    • 检测颗粒电荷, 又叫 Zeta 电位
    • 外泌体表面 marker 的检测
      • WB 或者免疫荧光
      • HSP70
      • TSG101
      • CD63
  • 定性 - 分子类型
    • 分泌蛋白
      • ELISA
      • 组织细胞蛋白的免疫检测用 western,而体液样本的分泌蛋白检测用 ELISA
    • 非编码 RNA
      • qPCR
      • 芯片
      • 测序

# 第五步

观察受体细胞吸收情况。分子或者囊泡荧光示踪是观察受体细胞摄入的金标准证据

  • 外泌体 → 荧光染料标记外泌体 → 观察
  • 小分子 → 标记分子 → 观察

# 第六步

极为关键的一步,观察受体细胞中,随着供体细胞基因操作产生的主变量表达变化,以及表型变化。

  • 判断分子是否是外源增加 → 前体?成熟体?
  • 检测相应表型变化

# 第七步

动物表型实验验证。

  • 直接操作分子
  • 在供体细胞操作分子 → 上清或者提取物来注射动物模型

# 第八步

分子机制方面的挖掘。

  • 受体细胞
    • miRNA 与靶基因验证
    • miRNA - mRNA 直接或 miRNA - 通路间接
    • Rescue
  • 供体细胞
    • 主变量操作方式
      • 分子操作
      • 阻断外泌体
      • 直接操作受体细胞
    • 跨细胞的 Rescue

# 第九步

做上游,即影响主变量变化因素。外泌体特异性识别受体细胞的膜蛋白也算上游

  • 主变量本身变化角度
    • 基因 DNA
    • 转录
    • 转录后
    • 翻译
    • 翻译后
  • 分泌角度
    • 直接分泌
    • 囊泡运输
    • 都有相关的标志物
  • 特异性受体角度

# 第十步

各个环节的 Rescue。除了主变量介导表型依赖于因变量,还需要证明主变量介导表型依赖于细胞交互


# 外泌体 - lnc/circRNA

把主变量从 miRNA 换成 lncRNA 或者 circRNA 的时候,数据论证的基本格式并没有 发生显著的变化。可以按照以上十步验证。只是在机制部分研究不大相同而已

lncRNA 结合其具体机制进行实验设计。