实验设计思路 | 外泌体研究 - 实验设计思路 - 科研 | Mars Shoka = マースノートシェルフ = = 醫研書架 =

16 字口诀：细胞交互、横纵兼容、分泌吸收、跨越回复

# 数据扩充

单从受体细胞的效应途径看， miRNA 介导靶基因调节的研究设计和数据套路荧光素酶报告基因实验，以及反正正、反反反的 Rescue 是一致的，也符合结合位点验证规则。但是因为涉及到了 2 种细胞的交互作用，可想而知数据内容上会有不小的扩充：

供体细胞里 miRNA 的表达情况
miRNA 分泌情况
包裹在囊泡中的 miRNA 是否被受体细胞吸收

# 套路概述

上半部
- 供体细胞在疾病中介导主变量 miRNA 的表达改变
- 检测细胞培养上清中分泌的囊泡数量以及内含的 miRNA 数量变化
下半部
- 检测受体细胞接受了囊泡中的 miRNA
- 明确 miRNA 来自外源导入
- 明确 miRNA 并非受体细胞合成
- 解释清楚主变量 miRNA 的功能和靶基因机制

# 十步法

# 第一步

供体细胞的培养上清处理受体细胞 → 观察表型变化
相当于加药 → 用相应的法和标进行评价
其实是预实验

# 第二、三步

即寻找目标 candidates、验证其介导细胞交互功能。

表达差异
- 检测细胞上清的微泡或者外泌体里面分子的表达 → 找差异 candidates
- 制备上清样品 → miRNA 芯片、测序 → 功能验证
- 供受体细胞远 → 采用血清外泌体样本检测
正反回复
- 阻断分子形成
  - 在供体细胞过表达 / 沉默 miRNA → 上清刺激受体细胞 → 表型改变？
  - 一般做 loss of function 即可
- 阻断外泌体合成
  - 阻断囊泡合成 → 表型改变？
  - 中性神经鞘磷脂酶的抑制剂
  - 沉默关键基因： Rab27a

# 第四步

外泌体特色数据验证套路。

分离
- 有专业试剂盒
- 离心
- 色谱
- 过滤
- 基于高分子聚合物的沉淀和免疫亲和分离
定量
- 鉴定的数据有透射电镜（ TEM ）观察外泌体的形态照片
- 动态光散射（ DLS ）或者其他的方法分析颗粒粒径大小、颗粒密度
- 检测颗粒电荷，又叫 Zeta 电位
- 外泌体表面 marker 的检测
  - WB 或者免疫荧光
  - HSP70
  - TSG101
  - CD63
定性 - 分子类型
- 分泌蛋白
  - ELISA
  - 组织细胞蛋白的免疫检测用 western，而体液样本的分泌蛋白检测用 ELISA
- 非编码 RNA
  - qPCR
  - 芯片
  - 测序

# 第五步

观察受体细胞吸收情况。分子或者囊泡荧光示踪是观察受体细胞摄入的金标准证据。

外泌体 → 荧光染料标记外泌体 → 观察
小分子 → 标记分子 → 观察

# 第六步

极为关键的一步，观察受体细胞中，随着供体细胞基因操作产生的主变量表达变化，以及表型变化。

判断分子是否是外源增加 → 前体？成熟体？
检测相应表型变化

# 第七步

动物表型实验验证。

直接操作分子
在供体细胞操作分子 → 上清或者提取物来注射动物模型

# 第八步

分子机制方面的挖掘。

受体细胞
- miRNA 与靶基因验证
- miRNA - mRNA 直接或 miRNA - 通路间接
- Rescue
供体细胞
- 主变量操作方式
  - 分子操作
  - 阻断外泌体
  - 直接操作受体细胞
- 跨细胞的 Rescue

# 第九步

做上游，即影响主变量变化因素。外泌体特异性识别受体细胞的膜蛋白也算上游。

主变量本身变化角度
- 基因 DNA
- 转录
- 转录后
- 翻译
- 翻译后
分泌角度
- 直接分泌
- 囊泡运输
- 都有相关的标志物
特异性受体角度

# 第十步

各个环节的 Rescue。除了主变量介导表型依赖于因变量，还需要证明主变量介导表型依赖于细胞交互。

# 外泌体 - lnc/circRNA

把主变量从 miRNA 换成 lncRNA 或者 circRNA 的时候，数据论证的基本格式并没有发生显著的变化。可以按照以上十步验证。只是在机制部分研究不大相同而已。

lncRNA 结合其具体机制进行实验设计。

实验设计细胞交互研究