16 字口诀:细胞交互、 横纵兼容、分泌吸收、跨越回复
# 数据扩充
单从受体细胞的效应途径看, miRNA
介导靶基因调节的研究设计和数据套路荧光素酶报告基因实验,以及反正正、反反反的 Rescue 是一致的,也符合结合位点验证规则。但是因为涉及到了 2 种细胞的交互作用,可想而知数据内容上会有不小的扩充:
- 供体细胞里
miRNA
的表达情况 miRNA
分泌情况- 包裹在囊泡中的
miRNA
是否被受体细胞吸收
# 套路概述
- 上半部
- 供体细胞在疾病中介导主变量
miRNA
的表达改变 - 检测细胞培养上清中分泌的囊泡数量以及内含的
miRNA
数量变化
- 供体细胞在疾病中介导主变量
- 下半部
- 检测受体细胞接受了囊泡中的
miRNA
- 明确
miRNA
来自外源导入 - 明确
miRNA
并非受体细胞合成 - 解释清楚主变量
miRNA
的功能和靶基因机制
- 检测受体细胞接受了囊泡中的
# 十步法
# 第一步
- 供体细胞的培养上清处理受体细胞 → 观察表型变化
- 相当于加药 → 用相应的法和标进行评价
- 其实是预实验
# 第二、三步
即寻找目标 candidates、验证其介导细胞交互功能。
- 表达差异
- 检测细胞上清的微泡或者外泌体里面分子的表达 → 找差异 candidates
- 制备上清样品 → miRNA 芯片、测序 → 功能验证
- 供受体细胞远 → 采用血清外泌体样本检测
- 正反回复
- 阻断分子形成
- 在供体细胞过表达 / 沉默
miRNA
→ 上清刺激受体细胞 → 表型改变? - 一般做
loss of function
即可
- 在供体细胞过表达 / 沉默
- 阻断外泌体合成
- 阻断囊泡合成 → 表型改变?
- 中性神经鞘磷脂酶的抑制剂
- 沉默关键基因:
Rab27a
- 阻断分子形成
# 第四步
外泌体特色数据验证套路。
- 分离
- 有专业试剂盒
- 离心
- 色谱
- 过滤
- 基于高分子聚合物的沉淀和免疫亲和分离
- 定量
- 鉴定的数据有透射电镜(
TEM
)观察外泌体的形态照片 - 动态光散射(
DLS
)或者其他的方法分析颗粒粒径大小、颗粒密度 - 检测颗粒电荷, 又叫 Zeta 电位
- 外泌体表面 marker 的检测
- WB 或者免疫荧光
HSP70
TSG101
CD63
- 鉴定的数据有透射电镜(
- 定性 - 分子类型
- 分泌蛋白
- ELISA
- 组织细胞蛋白的免疫检测用 western,而体液样本的分泌蛋白检测用 ELISA
- 非编码 RNA
- qPCR
- 芯片
- 测序
- 分泌蛋白
# 第五步
观察受体细胞吸收情况。分子或者囊泡荧光示踪是观察受体细胞摄入的金标准证据。
- 外泌体 → 荧光染料标记外泌体 → 观察
- 小分子 → 标记分子 → 观察
# 第六步
极为关键的一步,观察受体细胞中,随着供体细胞基因操作产生的主变量表达变化,以及表型变化。
- 判断分子是否是外源增加 → 前体?成熟体?
- 检测相应表型变化
# 第七步
动物表型实验验证。
- 直接操作分子
- 在供体细胞操作分子 → 上清或者提取物来注射动物模型
# 第八步
分子机制方面的挖掘。
- 受体细胞
- miRNA 与靶基因验证
- miRNA - mRNA 直接或 miRNA - 通路间接
- Rescue
- 供体细胞
- 主变量操作方式
- 分子操作
- 阻断外泌体
- 直接操作受体细胞
- 跨细胞的 Rescue
- 主变量操作方式
# 第九步
做上游,即影响主变量变化因素。外泌体特异性识别受体细胞的膜蛋白也算上游。
- 主变量本身变化角度
- 基因 DNA
- 转录
- 转录后
- 翻译
- 翻译后
- 分泌角度
- 直接分泌
- 囊泡运输
- 都有相关的标志物
- 特异性受体角度
# 第十步
各个环节的 Rescue。除了主变量介导表型依赖于因变量,还需要证明主变量介导表型依赖于细胞交互。
# 外泌体 - lnc/circRNA
把主变量从 miRNA
换成 lncRNA
或者 circRNA
的时候,数据论证的基本格式并没有 发生显著的变化。可以按照以上十步验证。只是在机制部分研究不大相同而已。
lncRNA
结合其具体机制进行实验设计。